调节动脉粥样硬化中脂代谢的小RNA

1、调节动脉粥样硬化中脂代谢的小RNA摘要：最近miR- 33a/ b被发现是代谢包括胆固醇和脂肪酸稳态关键调节剂。这些内含子小RNA被嵌入固醇响应元件结合蛋白基因， SREBF2和SREBF1，其编码的转录因子，协调胆固醇和脂肪酸的合成。通过抑制多种参与胆固醇流出和脂肪酸氧化的基因，包括ABCA1 ， CROT ， CPT1 ， HADHB和PRKAA1，miR- 33a/b与宿主基因一起以提高细胞甾醇水平。最近在动物模型中的研究表明，抑制这些小的非编码RNA的对脂蛋白代谢的有较强的影响，包括提高血浆HDL（高密度脂蛋白）和减少VLDL(极低密度脂蛋白)甘油三酯。此外，其他的小分子RNA被发现，

2、也针对ABCA1途径，其中包括miR- 758 ，表明miRNA可以协同工作来规范这一途径。这些令人振奋的研究结果支持microRNA拮抗剂的发展为治疗血脂异常，动脉粥样硬化及相关代谢性疾病提供了潜在的治疗方法。小RNA的发现及其在人类基因表达调控中的作用是在过去十年中最激动人心的科学突破。这些短（22个核苷酸）非编码RNA通过序列特异性杂交与信使RNA 3非编码区（ 3UTRs）的靶标位点互补来抑制基因的表达。通过改变mRNA的稳定性和/或抑制mRNA的翻译，小RNA表现出在另一个层面之上控制转录的微调，并显著改变细胞行为。因为最初他们在秀丽隐杆线虫中发现的miRNA，超过700miRNA已

3、经在人类基因组中确定的，并且预测超过三分之一的人类基因通过这些小RNA进行调节。许多这些miRNA在跨物种中是高度保守的，突出作为调节基因表达的这些分子进化的重要性。单个的miRNA可以同时调节多个靶基因的表达，从而提供了一种机制，以调节基因的整个网络。至今，小RNA已被证实在许多生物过程中起到了不可或缺的作用，包括免疫应答，发育，干细胞分化和最近的脂代谢。最近我们和其他工作团体定义了两种基因内miRNA，代表了内固醇响应元件结合蛋白的基因SREBF2和SREBF1 ，是代谢途径的关键调节。SREBF2和SREBF1基因编码的转录因子， SREBP1和SREBP2 ，在调节脂肪酸和胆固醇代谢中

4、的角色是公认的。然而，发现miR- 33a和miR- 33b嵌入在这些基因中出现一个明显的反馈桐庐，需要的时候可以推动细胞内脂肪酸和胆固醇水平。根据启动SREBPs转录的条件，miR 33a/ b与宿主基因共表达和往复调节基因参与胆固醇的流出/ HDL合成（ ABCA1 ， ABCG1和NPC1 ），脂肪酸氧化（ HADHB ， CROT ， CPT1A ），和极低密度脂蛋白甘油三酯代谢（ AMPKa ， SREBP -1）。这些基因的调控元件共同努力，从而微调细胞中胆固醇和脂肪酸的水平。虽然2004年报道了miR- 33a的基因组位置，但直到2010年，这个位置的功能和意义一系列平行研究才建

5、立。采用基因芯片筛选方法，雷纳等人鉴定的miR- 33a为巨噬细胞20种microRNA的一种并表明其平行表达的SREBF2改变细胞内胆固醇含量。其他两个团队，纳杰菲舒什塔利等人与马夸特等人，通过在硅片srebf基因的生物信息学分析发现了miR 33。每一项研究证实，在固醇耗竭条件下，mir-33a与宿主基因共同转录REBF2。所有三个团队指出，目标预测算法放在一个非常有趣的潜在的候选的miR- 33的靶基因的列表的顶部：ATP结合盒转运ABCA1负责游离胆固醇从细胞移出和新生的HDL颗粒的生成。这个发现强调了miR - 33在调节胆固醇平衡方面潜在的重要性。的确， ABCA1的3UTR包含三

6、个高度保守的结合位点miR- 33a和/或miR- 33b和ABCA1 mRNA的表达位点和多种细胞类型的miR -33的过表达使蛋白质的表达强烈受抑制，尤其是肝细胞。尽管ABCA1对肝的作用本质上是其对HDL的生物作用，在巨噬细胞中ABCA1的表达用于输送过量的胆固醇出小区的临界称为反向胆固醇运输的方法。miR- 33的过表达在巨噬细胞中被发现，以减少ABCA1的表达，从而抑制载脂蛋白A介导胆固醇的流出。相反，抑制巨噬细胞中的内源性的miR- 33的增加和ABCA1表达，增强脂质巨噬细胞胆固醇流出，凸显这一途径中miR- 33的生理重要性。除了控制ABCA1的表达，我们小组确定了miR- 3

7、3控制涉及细胞中胆固醇运输的两个其他蛋白质：ABCG1 ，其释放胆固醇转向HDL；NPC1 ，其输送胆固醇从溶酶体区室向细胞其它有此需要的的部分。鼠的ABCG1基因的3UTR含有两个的miR- 33结合位点，但这些位点在人的3UTR不保守。在小鼠细胞，但不是人类起源的巨噬细胞中miR- 33过表达证实了miR -33抑制ABCG1表达，说明这种基因受miR - 33的种属特异性调控。小鼠来源的ABCG1细胞靶向的功能结果证明了miR- 33过表达后减少了胆固醇流出到HDL。此外，人类NPC1的3UTR含有两个的miR- 33结合位点，从而导致在人巨噬细胞和肝细胞NPC1蛋白表达受miR -33

8、的抑制。NPC1与ABCA1一致行动使胆固醇流出到载脂蛋白A1 ，这表明了在人类细胞中的第二部分miR -33的抑制胆固醇的流出途径。这些研究突出了一个单一的miRNA如何同时控制同一途径的数个基因，以协调地调节细胞内环境稳定。miR - 33 / SREBF / ABCA1轴的识别简洁的例证的本质是介导miRNA的转录后基因调节。然而，早期的研究最初只关注miR- 33a而对miR- 33b却很少知道。值得注意的是，miR- 33a的进化过程是高度保守的，而的miR- 33b只存在于中型和大型哺乳动物SREBF1基因中。虽然miR- 33a和b之间19个核苷酸的成熟形式有两个不同，但它们具有

9、相同的关键序列（核苷酸1至8或2至9） ，用于定位和功能的最关键序列。生物信息学分析预测miR- 33a和的miR- 33b很大程度上抑制基因的同一个子集，迄今为止，一直没有发现目标基因受miR - 33a和miR- 33b共同抑制。然而，由于这些微小RNA与宿主基因是共转录的，所述的miR- 33a的和b的相对含量是有可能通过SREBF2和SREBF1诱导条件来调节的 ，并且因此可以是完全不同的。有趣的是， SREBF2 mRNA在肝脏中的相对含量是显著小于SREBF1 （10） ;它将被预测的miR- 33a的含量是比miR- 33b的含量低。此外，在影响SREBF1转录中升高的条件下，如

10、高胰岛素血症中，miR- 33b的水平，也显著地增加，并预测可显著地影响它的靶基因。事实上，代谢综合征包括高血浆胰岛素水平和高密度脂蛋白循环低 - 可能部分原因是由于肝增加转录SREBF1 /miR- 33b和导致ABCA1表达减少。而这种假设仍然在人中进行测试，它是一种miRNA可在生理和病理状态产生深刻影响的实例。miR- 33抑制动物模型中高密度脂蛋白胆固醇的增加通过体内递送的miR-模拟小RNA的选择性调制（双链寡核苷酸替换微RNA的功能）或抗miR的（单链寡核苷酸抑制剂）允许的miRNA功能和生理意义的调查。在小鼠体内这些研究已经显示miR- 33a的使用变构的反义寡核苷酸 ，病毒引

11、起的抑制剂，增加肝细胞ABCA1表达和高密度脂蛋白循环近40%。这些研究中证实在生理上miR- 33调节在小鼠中的HDL循环水平是至关重要的，并建立了miR- 33的抑制作为靶向治疗的可能性，升高HDL和为动脉粥样硬化提供保护。这些miR- 33拮抗作用研究的结果通过最近敲除小鼠的miR- 33基因来证实的。小鼠SREBF2内含子miR- 33a的靶向缺失对存活力或生育力没有影响，而定位策略的使用不破坏SREBP2功能。miR- 33缺陷的小鼠血浆HDL胆固醇水平比野生型C57BL / 6的小鼠高25 至40。出人意料的是，而对雄性和雌性小鼠来说，高密度脂蛋白的含量没有差异，但使用miR -

12、33的药物抑制剂，据报道miR- 33基因敲除雌性小鼠与雄性小鼠相比，在血浆HDL上有较大升幅。这种差异的分子机制目前尚不清楚，但指出可能是miR -33在雄性和雌性的生物学潜力不一样。由于高密度脂蛋白的静态测量推断其功能具有先天的局限性，以进行验证，增加HDL胆固醇有很重要功能性后果。越来越多的证据表明，血浆HDL的绝对水平比这高密度脂蛋白促进胆固醇的去除能力去外围组织的重要性低（如动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞）以废物排泄的过程被称为反向胆固醇运输。使用体内测定法来测量胆固醇逆向转运的效率，雷纳等人发现，miR -33的功能是抑制产生的高密度脂蛋白和增加的细胞的放射性标记的胆固醇运输到血浆，肝

13、脏和排泄物。值得注意的是，高密度脂蛋白的动脉保护特性被保留在抗miR -33处理的小鼠中，尤其是其促进巨噬细胞的胆固醇流出和以保护细胞因子引起的炎症的内皮细胞的能力。这些研究表明了miR -33的抑制可能对动脉粥样硬化是一个有希望的治疗方法。在动脉粥样硬化的小鼠模型中，载脂蛋白A1的过度表达来提高HDL已经显示出妨碍斑块进展和促进回落。此外，在载脂蛋白E缺陷小鼠中直接注入高密度脂蛋白，胆固醇喂养的兔子，或人类受试者的既定的动脉粥样硬化斑块的减少尺寸。同样，在小鼠建立动脉粥样硬化，miR- 33的抑制产生了动脉粥样硬化病变的明显消退，这是在于噬斑尺寸特征的减小，脂质和巨噬细胞含量减小过渡到更稳定

14、的斑块型。值得注意的是，抗miR -33寡核苷酸，侵入巨噬细胞动脉粥样硬化斑块，直接增加ABCA1的表达，有可能增加这些细胞胆固醇流出和降低整体斑块胆固醇含量。此外，通过巨噬细胞分离出的牙菌斑基因表达分析，激光捕获显微切割表明在炎症基因表达量的降低。因此，抗miR -33治疗的好处是双重的：它增加了肝ABCA1表达，高密度脂蛋白循环和反向胆固醇运输，以及增加巨噬细胞的胆固醇斑块的流出，从而结果是损伤回归和过渡到一个更稳定的表型。miR- 33对小鼠脂肪酸代谢抑制的影响有趣的是，果蝇miR- 33a具有一个高度保守的成熟形式，但这些生物都不能合成类固醇。这个发现指出，miR -33有更广泛的作用

15、，并引起了miR- 33a/b对额外的目标的识别。Guerin等人和达瓦洛斯等人证明，除了参与胆固醇转运靶向基因中，miR- 33还控制涉及脂肪酸氧化途径的基因。肝细胞中miR- 33的过表达下调CPT1A ， CROT，HADHB和PRKAA1的表达，（AMP Kinase ; AMPK1 ） ，降低脂肪酸的氧化并增加甘油三酯积聚。重要的是，抑制内源性的miR- 33导致CPT1A ， CROT和HADHB的低表达，并增加脂肪酸氧化。这些研究扩大我们对miR - 33在调控生物脂质平衡中的理解，并表明了miR - 33有重要影响，超越了其作为一个高密度脂蛋白的调节作用。在非人类的灵长类动物的

16、研究而这些早期在小鼠的研究强调了的miR - 33抑制治疗提高血浆高密度脂蛋白，这些研究结果外推到人类是复杂的，事实上，小鼠缺乏mir-33b。虽然在啮齿类动物mir-33b是不存在的，在非人灵长类动物这型的miR - 33的存在也有助于在人类高度相关的模型中的高密度脂蛋白和脂肪酸的代谢调控来研究SREBF1基因。全身植入的抗miR -33寡核苷酸设计为同时抑制miR- 33a和miR- 33b，12周内非洲绿猴肝在增加ABCA1基因的表达而诱导的血浆HDL持续增加。在这个模型中，miR- 33的抑制，8周后诱导最大密度脂蛋白增加50 ，这是持续在整个研究中。值得注意的是， miR- 33的拮

17、抗作用在该非人类灵长类动物模型中也显著的降低了血浆甘油三酯。在4周这种减少是明显的，研究结束时减少到最大值的50。血浆脂蛋白的分级显示，这是来自于降低VLDL-相关联的甘油三酯，主要是新近从肝脏分泌的大的VLDL颗粒。经处理的猴的肝基因表达分析表明，抗miR -33增加ABCA1 mRNA和蛋白的表达，以及脂肪酸氧化途径中 CPT1A ， CROT和HADHB是关键成员。此外，抗miR -33处理12周后，也有 SREBP- 1的mRNA和蛋白水平的显著降低。脂肪酸合成的关键调节剂和宿主基因miR- 33b的减少，是令人吃惊的，它没有的miR- 33的直接靶向目标。然而，进一步的分析表明，增加

18、肝表达AMPK1（由PRKAA1编码），这是SREBP- 1途径的负调节物，也的miR- 33的直接靶向。值得注意的是，除了SREBP- 1降低，抗miR -33处理过的猴的肝脏显示在参与脂肪酸合成这种转录因子的下游，包括脂肪酸合酶（ FASN ） ， ATP柠檬酸裂解酶和乙酰辅酶A羧化酶的关键基因的表达的减少。因此，通过经由HADHB ， CPT1A和CROT的去抑制同时增加脂肪酸氧化，并且通过抑制的SREBP- 1途径降低脂肪酸合成（ SREBF1 ， FASN ， ACLY ， ACACA ） ， 抗miR -33处理导致血浆VLDL甘油三酯显著减少。这些研究结果表明了在小鼠中研究miR

19、- 33的局限性，因为miR- 33b和AMPK1的3UTR的靶位点只存在于高等哺乳动物中。这一突破性的研究建立在高度相关的人体模型中，即的miR- 33a和b的药理学抑制是一种很有前途的治疗策略，以提高血浆HDL和降低VLDL和血脂异常的治疗，降低心血管疾病的风险。低HDL ，高VLDL甘油三酯通常与代谢综合征相关，miR- 33抑制剂可能为这一日益严重的健康问题的处理具有临床实用。值得注意的是，在小鼠和猴， miR- 33的抑制也增加肝表达IRS2，胰岛素信号传导的关键组分，在代谢综合征中也变得不正常。miR 33a/b过表达降低IRS2水平并抑制下游信使级联活化，包括AKT。此外，miR

20、- 33a/b还针对FSR2已建议通过召集Src同源磷酸酶2 （ SHP2 ）参与胰岛素信号和RS2相似分子以用作对接。研究迄今所用的动物模型的血糖正常，未来的研究，以充分理解的miR- 33对胰岛素信号传导和糖尿病的影响是重要的。其它调节脂代谢的miRNAmiR-758除了与miR- 33 ，最近的一项研究确定的miR- 758作为ABCA1的第二个靶microRNA。就像miR- 33，miR- 758抑制人类和小鼠巨噬细胞ABCA1的表达，降低细胞内胆固醇流出到载脂蛋白A1。此外，miR- 758在肝脏中高表达，并且显示出调节ABCA1的表达，在人类和小鼠的肝细胞中miR- 758的过表

21、达 ，这表明它可能在调节HDL中发挥生物作用。不同于miR- 33，miR- 758是一种基因间的miRNA ，介导其调控的因素在很大程度上是未知的。根据其在调节ABCA1中的角色，miR- 758的作用是下调巨噬细胞和从高胆固醇饲料喂养的小鼠之后大多数组织的胆固醇负荷。因此， miR- 33和miR- 758可协作以下调胆固醇耗竭条件下的ABCA1 ，然而存在于细胞ABCA1 3UTR的开头的三个miR- 33结合位点表明，这种的miR可能与靶向ABCA1有较高的疗效。总之，这些研究结果表明， ABCA1的转录后调控表达可能涉及几种不同的miRNA以及miRNA各自的生理意义的将通过其相对的

22、组织表达来确定。值得注意的是，有一种miR- 758比miR- 33更高表达的组织是大脑。ABCA1在大脑中的水平已显示出具有负相关淀粉样蛋白的负载，ABCA1基因靶向治疗正在积极地研究在阿尔茨海默病。在大脑中， ABCA1释放胆固醇流向载脂蛋白E，这是脑在阿尔茨海默病上已建立的遗传风险因素的主要胆固醇载体。在阿尔茨海默氏病的小鼠模型中， ABCA1基因缺陷加剧淀粉状蛋白，而过量的ABCA1可改善淀粉样蛋白负荷，暗示对ABCA1中A的代谢起关键作用。因此，操纵miRNA靶向ABCA1 ，如miR- 33和miR- 758，可能是阿尔茨海默氏病以及急性脑损伤的潜在治疗方式，其中载脂蛋白E促进神经

23、元的恢复。miR-122胆固醇代谢也已发现被广泛地受肝脏中最丰富的miRNA，miR -122 调节。miR- 122占肝脏总miRNA的表达的70 ，并与肝脏代谢的调节以及丙型肝炎病毒感染和肝细胞癌（ HCC）相关联。在体内miR- 122的靶向抑制策略揭示这个微小RNA与肝相关的生理。miR- 122在小鼠中沉默，导致了同时在LDL和HDL的级分观察到血浆总胆固醇持续降低。基因表达阵列分析表明，miR- 122的抑制，下调牵连肝代谢的几个基因和肝细胞产生的增加数百个基因通常被抑制表达，这表明这个微小RNA在维持肝表型具有重要的作用。此外，沉默高脂肪喂养的小鼠miR- 122,将其联系到一个

24、脂肪酸氧化的还原和刺激胆固醇的合成,降低脂肪肝。这些结果与miR -122控制FASN ， ACC1和ACC2表达-参与脂肪酸合成和氧化的所有基因的观察结果一致。随后LNAantagomirs在非人类灵长类动物针对的miR- 122的研究表明，与所观察到的小鼠相似，miR -122在非洲绿猴和黑猩猩中沉默引起总血浆胆固醇的大幅度减少，范围从20%至30 ，而在肝脏没有明显的毒性或病理变化。除了调节脂质代谢中，miR- 122已显示出在丙型肝炎病毒基因组的5的非编码区结合，并且这种结合在肝细胞中病毒积累和传播感染是必需的。值得注意的是，HCV感染的非人类灵长类动物，miR- 122的沉默导致HC

25、V病毒血症持续降低和改善肝病理学，没有证据表明具有病毒抗性。在这些非人类灵长类动物的研究的安全性和抗miR122的功能证明Miravirsen的进步，临床试验针对miR- 122与miRNA基因靶向治疗。第一阶段在健康受试者中发现的结果， Miravirsen具有很好耐受性，提供基于miRNA的治疗的进步是治疗慢性疾病。总结脂质代谢和动脉粥样硬化领域的miRNA的研究还处于起步阶段，因此，充分发现在这个研究领域具有巨大机遇。miR- 33a和b嵌入在SREBP基因，以及它们的活化的负反馈环路，可以帮助调节脂质代谢的发现，已大大提高了我们对控制脂质稳态机制的理解。同时，这些开创性的研究已经扩大到我们发现进行可类似地调节脂质代谢其他的潜在的miRNA。尽管最佳的药物治疗，以降低低密度脂蛋白胆固醇，血管疾病仍然是西方国家死亡的主要原因。通过输送miRmimics到目标体内微小RNA ，以提高微RNA功能，或抗miR的抑制微RNA的能力，为治疗血脂异常的发展开辟了新的途径，并提供了独特的方法，通过调节整个生物途径来治疗疾病。图1肝脏中miR- 33的靶向蛋白质同时参与多种代谢途径miR-33a/b肝中表达，细胞的ABCA1减少，导