动物细胞工程新

1、动物细胞工程离体植物器官、离体植物器官、组织或细胞组织或细胞愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体脱（去）分化脱（去）分化再分化再分化（芽、根）（芽、根）n植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养植物组织培养使用的培养基使用的培养基： 固体有机物（蔗糖）植物激素植物体植物体复习复习目的目的植物体植物体植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞植物细胞A 植物细胞植物细胞B 去细胞壁去细胞壁原生质体融合原生质体融合杂种细胞杂种细胞愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株植物组织培养植物组织培养植物细胞融合1、植物体细胞杂交的结果、植物体细胞杂交的结果是产生了？是产生了？2、这个过

2、程中涉及的原理是？、这个过程中涉及的原理是？杂种植株杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性 植物细胞的全能性植物细胞的全能性目的目的植物体植物体多莉多莉克隆猴克隆猴动物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段常用的技术手段动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体单克隆抗体核移植核移植动物细胞培养动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技技术是其他动物细胞工程技术的基础。术的基础。一、动物细胞培养一、动物细胞培养1.选材：选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。度低，容易培养

3、。v在进行动物细胞培养时，用在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶胰蛋白酶分散分散细胞，说明细胞间的物质主要是细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质蛋白质。动。动物细胞培养适宜的物细胞培养适宜的PH为为7.27.4，此环境下，此环境下胃蛋白酶（胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。2.分散成单个细胞分散成单个细胞3.动物细胞生长特性动物细胞生长特性：n细胞贴壁：细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。称为细胞贴壁。要求：要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。培养瓶或培养

4、皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。细胞的接触抑制：细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 动物细胞培养动物细胞培养动物细胞培养就是从动物有机体中动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织取出相关的组织,将它分散成单个将它分散成单个细胞细胞,然后然后,放在适宜的培养基中放在适宜的培养基中,让让这些细胞生长和增殖这些细胞生长和增殖.2.原理：原理：细胞增殖细胞增殖1.概念概念3.过程：过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器

5、官细胞悬浮液细胞悬浮液（单个细胞）单个细胞）胰蛋白酶胰蛋白酶动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质改变改变剪碎剪碎细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少

6、数细胞存活到活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。原代培养：原代培养：将动物组织消化后的初次培养将动物组

7、织消化后的初次培养至细胞贴壁至细胞贴壁,称为原代培养。称为原代培养。传代培养：传代培养：用胰蛋白酶将出现接触抑制用胰蛋白酶将出现接触抑制的贴壁细胞从培养瓶壁上脱离下来，制的贴壁细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液，分装到多个培养瓶中继续成细胞悬液，分装到多个培养瓶中继续培养，这个过程叫传代培养。培养，这个过程叫传代培养。 上述过程中，在第一培养瓶中培养到上述过程中，在第一培养瓶中培养到接触抑制就是原代培养，之后转移到其接触抑制就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养它培养瓶中培养就是传代培养细胞接触抑制细胞接触抑制 细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数细胞在贴壁生长过程中，随着

8、细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。细胞在体外培养中所需的条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。与体内细胞基本相同。n【讨论】【讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气和气体环境。体环境。2.体外培养的细胞需要什

9、么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。提示：无菌、无毒的环境。1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、动物血清、血浆、葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、动物血清、血浆、维生素、促生长因子等。维生素、促生长因子等。）3、温度和、温度和PH 36.5 +0.5度 ；PH为7.2-7.4。4、气体环境：、气体环境： O2和和CO2（95%空气和空气和5% CO2 ）补充合成培养基补充合成培养基中缺乏的物质中缺乏的物质4.动物细胞培养的条

10、件动物细胞培养的条件5.动物细胞培养的结果：动物细胞培养的结果：获得细胞群获得细胞群（1 1）生产蛋白质生物制品：病毒疫苗、）生产蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。干扰素、单克隆抗体等。（2 2）获得大量自身的皮肤细胞，用于）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。还可植皮。还可作为基因工程中的受体细胞。作为基因工程中的受体细胞。（3 3）用于检测有毒物质，判断某种物）用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。质的毒性。（4 4）用于生理、病理、药理等方面的）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据研究，为治疗和预防疾病提供理论依据5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培

11、养技术的应用思考：思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处

12、有：独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强使每一个细胞都能与培养液直接接触并进行物质交换，保使每一个细胞都能与培养液直接接触并进行物质交换，保证生命活动的正常进行。证生命活动的正常进行。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体动物个体获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无

13、病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目2 2、植物组织培养和动物细胞培养的比较、植物组织培养和动物细胞培养的比较二、动物体细胞核移植技术二、动物体细胞核移植技术:将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。这个

14、新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物用核移植的方法得到的动物称为克隆动物称为克隆动物核移植核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植（难度高难度高）受体细胞：受体细胞：M期的期的卵母细胞卵母细胞用核移植的方法得到的动物。用核移植的方法得到的动物。（M卵母细胞）卵母细胞）减数第二次分裂中期减数第二次分裂中期去核的卵母细去核的卵母细胞胞供体细胞供体细胞注入去核注入去核卵母细胞卵母细胞受体细胞激活，受体细胞激活，完成分裂、发完成分裂、发育育胚胎移胚胎移植植卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵

15、裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多莉羊的培育过程多莉羊的培育过程融合后的卵细胞融合后的卵细胞克隆羊的成功证明了什么？克隆羊的成功证明了什么？1、动物体细胞核具有全能性；、动物体细胞核具有全能性；2、细胞质具有调控细胞核发育、细胞质具有调控细胞核发育的作用。的作用。体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景畜牧业、医药卫生以及其他领域有着广泛应用前畜牧业、医药卫生以及其他领域有着广泛应用前景景1加速加速家畜遗传改良家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育进程，促进优良畜群繁育2保护濒危物种，增加动物保护濒危物种，增加动物 的存活数量的存活数量3可作为生

16、物反应器，生产医用蛋白，克隆动物细可作为生物反应器，生产医用蛋白，克隆动物细胞、组织、器官可作为移植的供体，了解胚胎发胞、组织、器官可作为移植的供体，了解胚胎发育及衰老过程、做疾病模型等育及衰老过程、做疾病模型等体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题1.许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。2.成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。胚胎移植技术胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程试管动物（婴儿）培养过程卵细胞卵细胞精子精子

17、体外受精体外受精受精卵受精卵胚胎胚胎新个体新个体母体子宫内母体子宫内孕育、产出孕育、产出克隆动物的研究意义克隆动物的研究意义1. 1.克隆动物作为生物反应器克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白，生产医用蛋白2. 2.改良动物品种改良动物品种 3. 3.治疗人类疾病，作为供体治疗人类疾病，作为供体4. 4.保护濒危动物保护濒危动物2.某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞准备对某种动物的肝肿瘤细胞(甲甲)和正常肝细胞和正常肝细胞(乙乙)进行动物细胞培养。下列说法正确的是进行动物细胞培养。下列说法正确的是()A在利用两种肝组织

18、块制备肝细胞悬液时，也可在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理用胃蛋白酶处理B细胞培养应在含细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞的呼吸的作用是刺激细胞的呼吸C甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象现停止增殖的现象D仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒c1(2009浙江卷浙江卷)用动、植物成体的体细胞进用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是行离体培养，下列叙述正确的是()A都需要用都需要用CO2培养箱培养箱B都需要用液体培养基都需要

19、用液体培养基C都要在无菌条件下进行都要在无菌条件下进行D都可体现细胞的全能性都可体现细胞的全能性C诱导方式诱导方式物理法物理法化学法化学法生物法：生物法： 灭活的病毒灭活的病毒仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性 （诱导细胞融合）（诱导细胞融合）一、动物细胞融合一、动物细胞融合1.方法方法2.灭活病毒诱导细胞融合的原理：灭活病毒诱导细胞融合的原理：n病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重聚，

20、细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。n灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏这些病原体的失去感染能力，但并不破坏这些病原体的抗原结构。抗原结构。3.用途：制备单克隆抗体用途：制备单克隆抗体灭活的病毒颗粒灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗细胞膜被病毒颗粒穿通粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）（细胞膜具有一定的流动性）细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核 动物细胞融合过程示意图动物细胞融合过

21、程示意图二、单克隆抗体二、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。淋巴细胞产生抗体。B淋巴细胞与抗体淋巴细胞与抗体B淋巴细胞受抗原刺激后，可以淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。产生抗体。动物体内的动物体内的B淋巴细胞可以产生淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。原具有特异性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。体。单

22、克隆抗体单克隆抗体 由单个由单个B淋巴细胞经过无性繁殖淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为异性强的抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体。 特点：特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 单单: 单个细胞单个细胞克隆克隆: 无性繁殖无性繁殖抗体抗体: 化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强n体外培养的条件下，一个体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可淋巴细胞是不可能无限增值的，如何使单个淋巴细胞增殖呢？能无限增值的，如何使单个淋巴细胞增殖呢？如何大量生产单克隆

23、抗体？如何大量生产单克隆抗体？n利用淋巴细胞产生抗体的功能利用淋巴细胞产生抗体的功能n利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用肿瘤细胞无限增殖的特性n利用细胞融合的技术将两种细胞融合利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞杂交瘤细胞n利用动物细胞培养技术大量培养杂交利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞瘤细胞1 1、单克隆抗体制备过程、单克隆抗体制备过程 注射注射 抗原抗原效应效应B淋巴淋巴细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体诱导其融合的方诱导其融合的方法有哪些？法有哪些？思考：思考：1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细细胞融合？胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体