传染性软化病病毒（桐乡株）的nested RT-PCR检测及

1、传染性软化病病毒（桐乡株）的nested RT-PCR检测及其RNA聚合酶的克隆和表达    英文题名 Detection of Infetious Flacherie Virus(Chinese Isolate) by Nested RT-PCR and Expression of the Viral RNA Polymerase  中文摘要 病毒性软化病是一种严重影响蚕业生产的流行病,其病原为传染性软化病病毒(infectious flacherie virus, IFV)。虽然类似软化病的情况在许多国家都有发生,但确切分离到IFV毒株的只

2、有日本。作为世界上最大养蚕国的中国,在分离鉴定IFV上存在着很长一段时间的空白。 本实验室2002年在桐乡蚕区分离到一株RNA病毒,在形态学观察等基础上,本研究用两对嵌套引物对该病毒进行分子鉴定。Nested RT-PCR结果证明该病毒在两轮反应中均能特异性扩增出与预期大小一致的片段。回收目的条带进行测序后得到一段217bp的序列,通过BLAST搜索,发现该片段与IFV日本株相应区域匹配,核苷酸序列相似性达99.5%,氨基酸完全同义。由此可确定该病毒为IFV,这是我国首次分离到该病毒,暂命名为IFV Zhejiang01/2002/CHN。 以IFV Zhejiang01/2002/CHN基因

3、组RNA为模板,用RT-PCR扩增了其RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)编码区全长序列。将片段连入pMD18-T载体进行克隆。测序显示编码RdR. 英文摘要 Flacherie disease of silkworm, Bombyx mori is a viral disease causing serious loss of sericulture. The causative agent of this disease  摘要 8-9 ABSTRACT 9-10 第1章 文献综述 11-39   &

4、#160; 1.1 小RNA病毒概况 11-21         1.1.1 小RNA病毒的分类学地位 11         1.1.2 小RNA病毒的结构特征和化学组成 11-13         1.1.3 小RNA病毒的复制 13-16         1.1.4 小RNA病毒的翻译 16-18  &#

5、160;      1.1.5 小RNA病毒的蛋白质加工 18-20         1.1.6 昆虫小RNA样病毒 20-21     1.2 传染性软化病病毒(IFV)研究进展 21-30         1.2.1 软化病及其病原的研究历史 21-22         1.2.2 IFV粒子的形态结构和

6、理化特性 22-23         1.2.3 IFV的基因组 23-24         1.2.4 IFV的蛋白组 24-27         1.2.5 IFV的病理学 27-28         1.2.6 IFV的分类学地位 28-29       

7、;  1.2.7 IFV的检测手段 29-30     1.3 RNA依赖性RNA聚合酶研究进展 30-39         1.3.1 RdRp的分类和功能 30-31         1.3.2 RdRp的整体结构 31-32         1.3.3 RdRp的结构域 32-34      

8、   1.3.4 RdRp的保守基序 34-35         1.3.5 RdRp的催化机制 35-37         1.3.6 RdRp在抗病毒治疗中的应用 37-39 第2章 IFV(桐乡株)的nested RT-PCR检测 39-47     2.1 材料 40         2.1.1 生物材料 40  

9、60;      2.1.2 酶和试剂 40         2.1.3 引物 40         2.1.4 溶液 40     2.2 方法 40-44         2.2.1 病毒的增殖 40-41         2.2.2

10、病毒的纯化 41-42         2.2.3 RNA模板的制备 42-43         2.2.4 RT-PCR 43-44         2.2.5 PCR产物测序及BLAST搜索 44     2.3 结果 44-45         2.3.1 Nested RT-PCR

11、结果 44-45         2.3.2 BLAST搜索和序列分析 45     2.4 讨论 45-47 第3章 IFV(桐乡株)RNA聚合酶的克隆及序列分析 47-60     3.1 材料 48-49         3.1.1 病毒 48         3.1.2 载体和菌株 48   

12、0;     3.1.3 引物 48         3.1.4 酶和其他试剂 48-49         3.1.5 溶液和培养基 49     3.2 方法 49-54         3.2.1 病毒RNA的抽提 49         3.2.

13、2 反转录 49         3.2.3 PCR扩增RdRp 49-50         3.2.4 扩增片段的回收 50         3.2.5 连接 50-51         3.2.6 感受态细胞的制备 51-52         3

14、.2.7 转化 52         3.2.8 抽提质粒DNA 52-53         3.2.9 重组质粒的鉴定 53         3.2.10 质粒的序列测定 53         3.2.11 序列分析和进化树的构建 53-54     3.3 结果 54-58  

15、;       3.3.1 RdRp的RT-PCR扩增 54-55         3.3.2 重组质粒的PCR和酶切鉴定 55         3.3.3 RdRp序列的测定和分析 55-56         3.3.4 RdRp多重序列对比 56-57       

16、  3.3.5 系统发育树的构建 57-58     3.4 讨论 58-60 第4章 IFV RdRp在杆状病毒表达系统中的表达 60-72     4.1 材料 61-62         4.1.1 质粒、菌种和细胞 61         4.1.2 引物 61         4.1.3 酶和其他试剂 61-6

17、2         4.1.4 溶液和培养基 62     4.2 方法 62-68         4.2.1 RdRp片段的扩增和回收 62         4.2.2 供体质粒的构建 62-64         4.2.3 重组供体质粒的鉴定和测序 64   &#

18、160;     4.2.4 转座 64-65         4.2.5 重组Bacmid的分离 65-66         4.2.6 重组Bacmid的鉴定 66         4.2.7 重组Bacmid转染BmN细胞 66         4.2.8 重组杆状病毒的收

19、集和增殖 66-67         4.2.9 蛋白表达和蛋白样品的制备 67         4.2.10 蛋白样品的SDS-PAGE 67-68     4.3 结果 68-70         4.3.1 RdRp片段的扩增 68         4.3.2 重组供体质粒的鉴定 6

20、8         4.3.3 重组质粒部分序列的测定 68-69         4.3.4 重组Bacmid的鉴定 69-70         4.3.5 蛋白样品的SDS-PAGE 70     4.4 讨论 70-72 结论和展望 72-73 参考文献 73-84 附录A 常用缓冲液和培养基 84-90 附录B 缩略词 90-91 附录C Bac-t

21、o-Bac系统工作原理 91-92 Writings&Sequences 92-93         4.2.10 蛋白样品的SDS-PAGE 67-68     4.3 结果 68-70         4.3.1 RdRp片段的扩增 68         4.3.2 重组供体质粒的鉴定 68     

22、60;   4.3.3 重组质粒部分序列的测定 68-69         4.3.4 重组Bacmid的鉴定 69-70         4.3.5 蛋白样品的SDS-PAGE 70     4.4 讨论 70-72 结论和展望 72-73 参考文献 73-84 附录A 常用缓冲液和培养基 84-90 附录B 缩略词 90-91 附录C Bac-to-Bac系统工作原理 91-92 Writings&am

23、p;Sequences 92-93         4.2.10 蛋白样品的SDS-PAGE 67-68     4.3 结果 68-70         4.3.1 RdRp片段的扩增 68         4.3.2 重组供体质粒的鉴定 68         4.3.3 重组质粒部分序

24、列的测定 68-69         4.3.4 重组Bacmid的鉴定 69-70         4.3.5 蛋白样品的SDS-PAGE 70     4.4 讨论 70-72 结论和展望 72-73 参考文献 73-84 附录A 常用缓冲液和培养基 84-90 附录B 缩略词 90-91 附录C Bac-to-Bac系统工作原理 91-92 Writings&Sequences 92-93         4.2.10 蛋白样品的SDS-PAGE 67-68     4.3 结果 68-70         4.3.1 RdRp片段的扩增 68         4.3.2 重组供体质粒的鉴定 68         4.3.3 重组质粒部分序列的测定 68-69