土壤中解磷细菌的分离与纯化

1、土壤中解磷细菌的分离与纯化（李其帅、林志军、王栋栋、周宏、孟海青、纪凯华）生科05级2班摘要：磷细菌是存在于自然界，主要是土壤中的一类溶解(dissolve)磷酸化合物(phosphate compound)能力较强的细菌的总称。通过磷细菌的作用，可使土壤中不能被植物利用的磷化物转变成可被利用的可溶性磷化物。故又称溶磷细菌。主要有两类，一类称为有机磷细菌，主要作用是分解有机磷化物如核酸、磷脂等；另一类称为无机磷细菌，主要作用是分解无机磷化物，如磷酸钙、磷灰石等。磷细菌主要是通过产生各种酶类或酸类而发挥作用的。可用它制成细菌肥料，实践证明，对小麦、甘薯、大豆、水稻等多种农作物，以及苹果、桃等果树

2、具有一定增产效果。农业上常用的菌有解磷巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium varphosphaticum），俗称为“大芽孢”磷细菌，此外，还有其他芽孢杆菌和无色杆菌（Achromobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）等。我们此次试验目的是从土壤中分离出无机解磷细菌，观察解磷细菌的细胞形态，并进行生理生化鉴定，进一步熟悉掌握微生物实验的基本技能。关键词：土壤 解磷细菌 无机磷细菌 含磷培养基 分离提纯 生理生化反应实验目的 1）掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。2）学习并掌握分离纯化无机解磷细菌的基本方法。 3）巩固和贯通所学的无菌技术、纯

3、培养技术、保藏技术、显微技术、等微生物操作技术。4）学习通过微生物的形态特征、生理生化反应来鉴别解磷细菌与其他微生物的异同。试验原理1） 菌种来源：由于各种微生物对营养物质需求不同，在不同地方采样对选取所要的微生物含量和其它杂菌含量的多少直接有关。所以要选择无机磷含量较高的土壤中采样。2） 培养基的选取：为了使所要的无机解磷细菌能生长，其它微生物生长受到一定的抑制，要用选择培养基。还要把解磷菌与其他微生物相区别，还要用鉴别培养基。为了达到即是选择培养基又是鉴别培养基，选取以磷酸钙为唯一磷源的培养基。这样又能起到选择培养的目的，又能通过有无解磷圈鉴别无机解磷细菌。3）培养及分离纯化：通过涂布培养

4、法、平板划线法等方法达到分离纯化的目的。4）保藏：通过分离纯化得到的菌种，接种与斜面培养基上，到一定时间后进行传代培养保藏，使其不死亡、减少突变所引起的生物学性状的改变。5）通过形态与染色鉴定：由于各种微生物有其特定的菌落形态特征和单细胞形态特征，可通过这些形态进行鉴定。还由于细胞壁组成不同可进行鉴别染色法进行鉴定，也可用产生不产生芽孢进行芽孢染色。通过以上方法可对所分离纯化的菌种进行初步的鉴定。6）通过生理生化反应进行鉴定：各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异，如表现在对对大分子糖类和蛋白质的分解能力，以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们有不同的酶系。我们在实验室允许的条件下做了糖类发

5、酵与氧化、是否能产生过氧化氢酶以及是否含有细胞色素氧化酶等生理生化试验，进行再次鉴定。 用品器材：洁净试管 培养皿500ml和250ml锥形瓶各一个，玻璃珠 高压锅 10ml和100ml量筒 1ml移液枪配枪头 牛皮纸 玻璃涂棒 接种环显微镜 酒精灯 载波片 盖玻片 擦净纸 双层瓶（香波油 二甲苯） 试管架 等无菌水 碱性美兰 石炭酸复红染色液 结晶紫 碘液 乙醇 番红 5%孔雀绿水溶液 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液。1%-萘酚乙醇溶液。3%过氧化氢水溶液等 无机磷培养基 葡萄糖 5.0克 硫酸铵 0.25克 NaCl 0.15克KCl 0.15克 7水硫酸镁 0.15克 磷酸钙 2.5克 4水

6、硫酸锰 0.015克 7水硫酸亚铁 0.015克 琼脂 8克 蒸馏水 500ml PH 7.0到7.2 糖酵解培养基 蛋白胨0.2%, 磷酸二氢钾0.03% 氯化钠0.5% 糖1% 琼脂 0.50.7% 溴百里酚0.003%。 PH 7.07.4分离纯化1 配置培养基和灭菌根据上述培养基成分，到药品室找到相应材料，用天平称量，加到500ml锥形瓶中，玻璃棒搅拌均匀（必要时加热），塞上棉塞，双层牛皮纸扎好口；试管塞上棉塞，用牛皮纸7个扎一捆；平皿6个一包，牛皮纸扎好，将它们同移液枪、玻璃珠、玻璃涂棒、量筒、100ml图锥形瓶放入高压锅进行高压蒸汽灭菌 ：121摄氏度下 20分钟。待用。2 在点燃

7、的酒精灯附近将培养基倒入平皿，冷却制成9个平板，待用3 取样并制备土壤稀释液 找一处含沙质较多的土壤，靠近植物根部取其表层5cm以下的土适量于塑料袋中带回实验室。称出10克于带有无菌玻璃珠的250ml锥形瓶中，用已灭菌的量筒量取90ml无菌水溶解，振摇约20分钟，使土样与水充分混匀。点燃酒精灯在火焰附近，用无菌移液枪从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌移液枪从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀释度的土壤溶液4 涂布。将上述 9个平板分别贴上标签10-

8、4、10-5、10-6各三个，然后用无菌移液枪分别由10-4、10-5、10-6 三管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中 ，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温下静置5到10分钟，使菌液吸附进培养基5培养。30摄氏度恒温室中培养3天6 观察并进一步分离纯化。 观察菌落特征，并记录。再倒两个平板。点燃的酒精灯附近，从稀释度合适的培养平板上挑取带有溶磷圈的菌落，在新制的平板上划线分离，30摄氏度恒温室中培养3天7斜面培养放置斜面。挑取单个菌落接种到3个斜面上培养。置于2830恒温箱中培养h.与此同时，用单菌落进行以下鉴定试验简单染色1.1  涂片

9、 取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴蒸溜水于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从菌种，菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。1.2固定与干燥将涂片在火焰较高处快速通过几次，使菌体固定在载玻片上后自然干燥。1.3 染色 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液12滴。吕氏碱性美蓝于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。染色12min， 。1.4 水洗 倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。1.5 。干燥 甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体） 1.5 。 

10、镜检 涂片干后镜检。采用油镜观察革兰氏染色  1.1 涂片 常规涂片法 1.2 初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于涂片上，染色12min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色。 1.3媒染 用碘液媒染约l min ，水洗。 1.4  脱色     用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，干燥。   1.5  复染 在涂片上滴加番红液复染约

11、23min ，水洗，然后用吸水纸吸干。1.6 镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。1.7 清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。芽孢染色1）将培养的菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约45分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约

12、76）染10分钟。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，理化试验一H2O2酶实验试验方法挑取固体培养基上菌落一接种环置于两片干净的玻片上，滴加3%过氧化氢溶液2mL于菌种上，观察结果，若半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。二糖发酵实验酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫Ph5.2(黄色)6.8（紫色），当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明1.配培养基：灭菌 110°C 20分钟 甘油采用121°C 20分

13、钟灭菌。2、编号，写标签。接种3、将上述以接种的淀粉，葡萄糖、蔗糖，密封于未密封的试管和对照管置于37温室中培养24小时。三 细胞色素氧化酶试验试剂1%盐酸二甲基对苯二胺溶液。1%-萘酚乙醇溶液。试验方法取37(或低于37)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各23滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。 实验结果（一）菌落特征；实验取10-4、10-5、10-6稀释度。其中菌落数分别为165、53、1

14、2个。最后一个稀释度只有一个培养基发现透明圈，其他培养基均发现有透明圈。其中有两种菌落有明显透明圈,特征为：1、 菌株一（暂命名为JP1）：菌落大小：13mm，形状：圆形，表面：光滑，有光泽、边缘整齐、半透明，颜色：淡黄色，低凸面。2、 菌株二（暂命名为JP2）：菌落大小：1mm，形状：圆形，表面：光滑，有光泽、边缘整齐、不透明，颜色：白色，凸面。选择其中JP1做为研究菌株（二）镜检结果：1、革兰氏染色：阳性。菌株一2、芽孢染色：有芽孢、形状为卵圆形。3、菌形：杆状。（三）生理生化特征：实验类型糖酵解H2O2 酶分解细胞色素C结果产酸不产气阳性结果分析： 先有镜检结果得知该菌为革兰氏阳性产芽孢

15、杆菌，由此查伯杰氏手册的第十五部分：芽孢杆菌和球菌的芽孢杆菌科芽孢杆菌属。确定为腊状芽孢杆菌属，拉丁名为：B.cereus。 伯杰氏手册中的描述为：实验总结时间通过实验，再次熟悉了微生物实验的有关操作。并且作为第一次系统的实验步骤，了解了完成一个实验的步骤流程，总结了一些经验。学会了使用伯杰氏手册。能够根据目的菌落选择适当的方法及培养基进行筛选，并为下一步实验保存了菌种。现对试验中的经验及改进方案总结如下：(一)：经验1、大家集体分工协作的方法及注意事项，利用公共邮箱共享资料。2、实验时间安排注意微生物生长时间，一般细菌三到五天即可，不同均根据情况调整，使微生物长势最好（二）：改进 1、计划要尽量详细，避免出现混乱的状况。 2、培养基现用现倒，培养基存放过长影响培养。参考文献：华北农学报 Acta Agriculturae Boreali-Sinica生态学杂志 Chinese Journal Of Ecology河南农业科学 Journal Of Henna Agricultural Sciences 现代微生物学与实验技术作者：林稚兰，黄秀梨主编微生物学实验指导 致谢词：本文是在庞昕老师精心指