重要植物病原细菌的高通量分子检测技术研究及应用

1、重要植物病原细菌的高通量分子检测技术研究及应用    英文题名 Development and Application of High-Throughput Plant Pathogen Molecular Detection Technology   关键词 padlock探针; 高通量; 分子检测; 植物病原细菌; 英文关键词 padlock probes; high-throughput; molecular detection; plant pathogenic bacteria; 中文摘要 在植物的发病早期快速、准确鉴定出病原菌,以防

2、止其传播和流行、减少经济损失具有重要的意义。发展快速、灵敏、高通量的分子检测技术对提升我国植物病害控制水平,尤其是阻止外来农林危险生物入侵、保护我国农林经济安全生产与生态安全有着重要意义。目前基于PCR技术的分子检测方法无法满足对大批量样本检测的需要,因此寻找其他的分子检测靶标,发展植物病原菌高通量检测方法,对完善病原细菌分子检测技术、提升我国植物检疫的技术水平和提升我国植物病害控制水平具有重要意义。 高通量是目前植物病原菌分子检测的发展方向,而基于PCR扩增的普通分子检测方法无法一次检测多种病原菌。因此,发展高通量检测方法对于农业生产和口岸检疫具有重要意义。分子探针和DNA阵列技术等技术的出

3、现为发展植物病原菌高通量检测提供了新的思路和方法。Padlock探针是一种长的寡核苷酸探针,其两端的序列可通过与靶标DNA序列互补配对而使探针结合成环状。Padlock探针不仅具有非常高的特异性,同时还可与DNA阵列技术结合进行高通量检测。本研究设计了6种重要植物病原菌(Erwinia amylovora,Erwinia pyrifoliae, Pantoea stew. 英文摘要 The failure to adequately identify plant pathogens from culture-based morphological techniques has led to t

4、he development of culture-independent molecular approaches. Increasingly, diagnostic laboratories are pursuing fast routine methods that provide reliable identification, sensitive detection 摘要 7-8 ABSTRACT 8-9 引言 10-11 上篇 文献综述 11-38     第一章 植物病原菌检测技术的研究进展 12-38     

5、;    1 常用的分子生物学检测技术 13-23             1.1 PCR及其相关技术 13-20                 1.1.1 扩增病原菌的致病性基因 14           

6、      1.1.2 rRNA-PCR 14-15                 1.1.3 ITS-PCR 15                 1.1.4 tDNA-PCR 15-16     

7、0;           1.1.5 Nest-PCR 16                 1.1.6 Multiplex-PCR 16                 1.1.7 Real-tim

8、e Quantitative PCR 16-19                 1.1.8 rep-PCR 19                 1.1.9 AFLP 19           &#

9、160;     1.1.10 Immuno-PCR 19-20                 1.1.11 IMS-PCR 20             1.2 DNA阵列技术 20-21          

10、;   1.3 Padlock探针 21-23         2 植物病原菌分子检测的具体特点 23-29             2.1 检测技术特点 24-28             2.2 经济要求 28-29      

11、0;  3 目前植物病原菌分子检测的局限 29-30         4 未来植物病原菌分子检测展望 30-32         参考文献 32-38 下篇 研究内容 38-70     第一章 重要植物病原菌的高通量分子检测技术研究 40-70         1 材料和方法 42-49      

12、;       1.1 供试菌株 42             1.2 培养基及溶液的配置 42-43             1.3 基因组DNA的提取 43-46             1.4 Padlo

13、ck探针的设计 46             1.5 探针的连接与外切酶处理 46             1.6 探针的扩增 46-47             1.7 Macroarray高通量检测 47      

14、       1.8 探针的特异性和灵敏度验证 47             1.9 对实际样品检测 47-49                 1.9.1 对市场哈密瓜种子的检测 47-48        &

15、#160;        1.9.2 对宁夏甜瓜样品检测 48                 1.9.3 对安徽自然发病越冬的水稻样品的检测 48-49                 1.9.4 对水稻种子样品的检测 49 &

16、#160;               1.9.5 人工接种发病的梨叶片的检测 49         2 结果与分析 49-60             2.1 探针设计结果 49-50        

17、0;    2.2 探针的特异性验证 50-51             2.3 探针的灵敏度验证 51-53             2.4 探针的高通量检测 53-55             2.5 对实际样品的检测结果 55-60

18、                2.5.1 对市场哈密瓜种子的检测结果 55-56                 2.5.2 对宁夏甜瓜样品检测结果 56-57            &#

19、160;    2.5.3 对安徽自然发病越冬的水稻样品的检测结果 57-58                 2.5.4 对水稻种子样品的检测结果 58-59                 2.5.5 人工接种发病的梨叶片的检测结果 59-60  

20、0;      3 讨论 60-62         参考文献 62-70 附录 利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌 70-80     1.材料与方法 71-74         1.1 参试菌株 71-73         1.2 菌悬液的制备 73     

21、;    1.3 引物设计与合成 73         1.4 PCR体系及反应条件 73         1.5 模拟种子带菌菌体PCR检测 73         1.6 对市售哈密瓜种子的检测 73-74     2 结果 74-76     3.讨论 76-78   

22、60; 参考文献 78-80                 2.5.4 对水稻种子样品的检测结果 58-59                 2.5.5 人工接种发病的梨叶片的检测结果 59-60         3 讨论 60

23、-62         参考文献 62-70 附录 利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌 70-80     1.材料与方法 71-74         1.1 参试菌株 71-73         1.2 菌悬液的制备 73         1.3 引物设计与合成 73  

24、;       1.4 PCR体系及反应条件 73         1.5 模拟种子带菌菌体PCR检测 73         1.6 对市售哈密瓜种子的检测 73-74     2 结果 74-76     3.讨论 76-78     参考文献 78-80     &

25、#160;           2.5.4 对水稻种子样品的检测结果 58-59                 2.5.5 人工接种发病的梨叶片的检测结果 59-60         3 讨论 60-62       

26、  参考文献 62-70 附录 利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌 70-80     1.材料与方法 71-74         1.1 参试菌株 71-73         1.2 菌悬液的制备 73         1.3 引物设计与合成 73         1.

27、4 PCR体系及反应条件 73         1.5 模拟种子带菌菌体PCR检测 73         1.6 对市售哈密瓜种子的检测 73-74     2 结果 74-76     3.讨论 76-78     参考文献 78-80            

28、;     2.5.4 对水稻种子样品的检测结果 58-59                 2.5.5 人工接种发病的梨叶片的检测结果 59-60         3 讨论 60-62         参考文献 62-70 附录 利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑

29、病菌 70-80     1.材料与方法 71-74         1.1 参试菌株 71-73         1.2 菌悬液的制备 73         1.3 引物设计与合成 73         1.4 PCR体系及反应条件 73         1.5 模拟种子带菌菌体PCR检测 73