专题组织细胞固定的原理基本要求和注意事项等

1、【专题】组织细胞固定的原理、基本要求和注意事项等在病理学中，组织只有经过固定，才能完成随后的一系 列制作过程，直至切片的最后完成。每个医学研究者都能容 易地把组织细胞固定起来，但是，要掌握组织固定的原理、 过程及其意义是一件十分困难的事，下面我们将逐一阐述。 一、固定的作用组织经一系列的处理后，就必须进行固定， 当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。固定的 作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的 固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结 构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内 蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应； 防止细胞的自溶，

2、以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织 的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性， 不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象， 才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物 的判断。二、固定的目的1、能防止细菌的腐蚀和组织的自 溶。细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组 织。固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都 由 蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了 活力。另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一 块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。因为组织离体后，供应这 此组织的血液随之消失，细

3、胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构 受到破坏，破坏后释放由溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉 变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液， 糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。细 胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶 酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。这些物 质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体, 很容易受到破坏，因此应特别小心。3、使组织硬化，便于切块。刚离体的组织，除了胃组织以 外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固 定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均, 粘膜和肌层很

4、容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就 必须将组织彻底固定，再行取材。4、对莫些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。病理标 本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病 种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。对于此类标本, 应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在 3-5 天。5、保存好大体标本。对于有教学任务的医院病理科，除搞 好疾病的诊断外，还有收集有价值的大体标本，有些大体标 本，是很难得到的。因此要求在平时就要留心观察，小心处理。遇到有教学价值的罕见的典型的标本，就必须及时固定，认真给予对待。6、可增强染色的作用。组织经过及时的固定，最终可见到 切片有鲜艳的染色

5、，而如果有一批未经及时固定的组织，将 看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论， 固定可以增强染色的作用。三、固定的注意事项1、组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好 的。根据实验，如果要获得莫些酶的染色，固定最好在组织 离体后30秒至1分钟。对于其它达不到些要求是越快越好。2、组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都 不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸 透度不够快的缘故。如果较大厚的组织，不经处理就进行固 定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶 了。因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材 料再行固定，这是最佳的

6、处理方法，如遇到胃肠的器官，则 应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固 定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时， 难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、 肾、脾等， 更要处理好，否则更容易由现自溶现象。3、对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。有的固定 液对于组织有膨胀作用。固定剂是一种化学试剂，有液体和固体之分，一般使用较多的是液体，而固体固定剂如多聚甲 醛，则多用于实验研究的组织固定。固定剂的种类繁多，成 份复杂，对组织的作用不尽相同，英国著名的组织化学专家 Pearse指由：对于每个既定的组织化学方法来说，选择最合适的方法是极为重要：在组织化学研究准备

7、阶段不论采用什 么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分 的反应基团的效用。Jones (1973 ),指由理想的固定剂必须 具备的条件是，防止渗透损伤和收缩，以达到在各级可见度 的水平皆无形态变化；要求组织所有的成分能保留于原位。他认为有三种试剂即甲醛、戊二醛和丙稀醛接近于达到上述 要求。为了更好地把组织中各种成分尽量保存好，尽量好给 予显示由来，就决不能千篇一律地使用一种固定液，而必须 认真地深入研究各种固定液的性能和使用方法。例如：丙酮,它对组织有明显的皱缩，硬化作用，平常它是决不会被用来 作固定液的，用它不但太浪费，造价太高，而且也使切片较 为困难，但是，对于莫些酶的研究，

8、狂犬病脑组织的固定， 莫些细胞的培养等。最好的固定液还是丙酮。因为如果使用 福尔马林固定液、石蜡切片显示酸碱磷酸酶就显示不好，狂 犬病病毒的包函体就会消失掉，又如醋酸，它对胶原纤维等 有膨胀的作用。由于各种固定液对不同的组织有不同的作用， 因此许多专家将根据各种固定液的优缺点，配制由许多混合 液的方法来，给组织的良好固定起到了非常积极的作用。但是，值得指由的是并非所有的固定液都不是十全十美的，例 如，酒精、甲醛、醋酸固定液，对组织固定很好，组织中各 物质的染色也十分清晰，但对固定脱水盒为铜质的组织时， 效果就不好，原因是醋酸跟酮可发生反应，产生醋酸铜，沉 淀于组织中，可造成对抗原的损害，对于免

9、疫组织化学的显 示，经实验证明：可呈弱阳性乃至阴性。由此可见，固定液 的选择正确与否决定着对莫些病例的免疫组化标记的成败 关键。在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针 对性的选择，方能获得满意的效果。4、组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。时间太短，就 不能很多的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织 之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定 的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以 保证，固定时间太长，也不好。组织长时间的固定，福尔马 林会产生一种酸，影响核的染色。对于固定很长时间的陈列 性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。另外，长时 间的固定往往会

10、由现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本， 更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性。5、固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固 定的成败，有的人认为，固定液的量与组织的比应是 20:1, 这个要求对于小组织来说是完全可以达到的，但对于大标本 来说，则是一件非常困难的事情。因为对于大医院来说，每天都有几十上百例的标本，小如大头针大小，大的达几十斤的肿瘤，对于这样大的标本，按 20: 1的比例来做，显然是 不可能的事，既要做到组织能固定好，又不使组织吹干就必 须具体情况具体处理。对于大的标本，原则上是不让其暴露 部分被吹干，这是因为在现实当中，大的标本往往露生容器 一大半，因此对于这种情

11、况，应取些脱脂棉或纱布，浸湿固 定液后，盖于组织表面，以免使组织被风干，影响制片效果。 6、特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例 标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液 来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述 的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可 选择无水酒精或丙酮来固定组织。固定剂是一种化学语试剂， 有液体和固体及之分，平常使用的多为液体，Pearse指由,对每个既定的组织化学方法来说，选用最合适的固定方法是 极为重要的；在组织化学研究中的准备阶段，不论采用什么 固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分反 应基团的效用。7、组

12、织的第二次固定或后固定。在一般的常规病理活检组 织中，往往用一种固定液，就能够达到目的，获得满意的结 果。但是，对于莫些特殊病例光用一种固定液是不够的，必 须根据不同的情况，使用特殊的固定液再次将组织固定，或 者在切片后染色前再行固定。这种方法称为二次固定或后固定。例如：胚胎性横纹肌肉瘤，由于肿瘤细胞发育较幼稚， 完全不象成熟的横纹肌组织所固有的横纹，在进行特殊染色 前，就必须用Zenker氏固定液进行第二次固定，方能较好 地显示由横纹肌纤维来。否则，效果不佳。另外，电镜固定 的标本，通常都需要后固定。其使用方法是先用戊二醛固定， 再用奥酸固定。四、固定液的使用当前，应用于固定试剂的 种类较多

13、，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用， 因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的 固定组织。根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四 种类型：I类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙 二醛等。n类:氧化剂类，四氧化钺（奥酸），高镒酸钾，重铭酸钾等。 田类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。IV类：其他，氯化汞，苦味酸等。上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其 它病理技术方面中用到。下面根据使用的需要，将着重介绍 几种常用的固定剂。1、甲醛：商品名为福尔马林，一般市 售的含甲醛37 40%,由甲醛气体饱和于水而成，比重为 1.12。它也可以稳

14、定的固体形式存在，它的成分为高分子量 的聚合体，称为多聚甲醛。甲醛溶液较难纯化，在每批市售商品中，都含有不少的杂质 如甲醇，这种在组织化学方法当中，能使酶钝化，影响其反 应。甲酸，它可使固定液变酸，在陈列标本或长时间固定的 组织，由于酸的作用，往往细胞核染色欠佳。甲醛有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交 联链。参与甲醛固定蛋白质的基团，主要为氨基，亚氨基及 酰氨基，肽，服基，羟基， SH和芳香环。甲醛与组织蛋白 类的反应是多样和复杂的，因为它能和多种不同的功能基团 结合，在多数情况下在其间形成桥键。甲醛有这种交联的功 能，也是它的缺点，在用甲醛固定过的组织中，需要做免疫 组化的，往

15、往提倡用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛 交联的醛键断裂开，以利于后来的染色。甲醛可配成简单的 或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法， 就是取10ml 甲醛液，加水90ml,这就是10%的福尔马林.当然，现在使用 的固定液要求较为严格些，最好是使用缓冲福尔马林固定液 ， 这将有利于后来的免疫组化染色的需要。从组织学的观点来说，甲醛是一种良好的固定剂，它有很多的 优点：组织收缩较少，损伤少，保存固有物质好；固定均匀， 穿透力强；能使组织硬化，增进组织弹性，有利于切片；能保 存脂肪及脂类物质； 成本较低。虽然甲醛有上述的优点，但这 都是相对而言，任何物质都不可能十全十美的，它也有许多缺 点：

16、杂质含量较多，如甲醇，可钝化酶类，影响反应；含有微量 甲酸，导致固定液酸变，影响染色；可产生福尔马林色素 ，影响观察；不能固定尿酸和糖类物质；容易挥发，污染环境，可导致标本干涸；可长期存在于固定过的组织上。有人做过实验组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后，仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合，但需要经过长时间的流水冲洗 (24天的 冲洗)方能除去.可见存在于组织上的甲醛是不可能除去的.因为临床活检不可能有这么长的时间来冲洗组织.因此要特别指由的是，在其后的各种技术操作中，要特别注意到甲醛的存 在,必须要想办法除去它，否则将会给各种染色造成影响，甚至 导致失败。应用甲醛，可以配成许多种固定液：1)

17、10%缓冲福尔马林固定液甲醛100ml蒸播水900ml NaH2PO4 4g Na2HPO4 6.5g 该固定液是当今流行的固定液，因它对组织固定较好，损伤较 少，因对其后的各方面的研究都较好，尤其是对免疫组化的染色.2) 10%福尔马林固定液甲醛100 ml 自来水900ml 这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用 这种固定液。3) 10%福尔马林盐固定液甲醛100ml自来水900mlNacl 9 克先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种较为简单的固 定液，但由于加入 Nacl,它是一种重金属盐物质，加入了它 可促进和改善

18、染色，增加染色的强度。4) Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 75ml甲醛2 ml冰醋酸5 ml该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲 醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此 间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平。5)醛糖钙固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸钙20g蒸锚水90ml先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸锚水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。从免疫组织 化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化 的手段来检测，据多人认为，它对 IgA , IgM ,

19、J链，K链 和人链的标记效果较好，且背景清晰。但美中不足的是：经 它固定的组织，可与蛋白形成醛交联蛋白，这种醛键可封闭 抗原。固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和 需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。2、酒精：又称乙醇，为无色透明的液体，沸点是 78度，工业酒精是95% o 酒精它有许多优点：1）存尿酸结晶和糖原等物质。高浓度 的酒精如95% ,无水酒精可保存上述两种物质，因它们易溶于水，因此，要证明上述两种物质的存在，就不能用含水的 固定液来固定组织。2）能在任何比例的情况下与水混合， 在病理技术中，酒精是一种十分重要的试剂，它起着关键的

20、 作用。如果没有酒精，将会无法完成必要的工作。如组织的 脱水，切片染色前后都离不开酒精，在常规的工作中，通常 都用95%的工业酒精来配成 60%、70%、80%、90%等不 同的浓度来使用。3）可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁 试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色， 能除去石蜡的物质有苯及汽油等，常用的有苯类试剂，苯不 溶于水，但能溶于酒精，酒精在这里充担着除去苯和连接水的作用，为切片入水架起了桥梁，因此称它为桥梁试剂。4）除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，由于所 用的试剂都为水溶液，因此在切片上含有大量的水份，这些 水份经系列梯度酒精的置换吸附后，到无水酒精中已完全

21、无 水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会 褪色。5）可用来保存标本。大体标本经福尔马林固定后，如为了陈列保存，必须取由冲冼。然后移入75%的酒精中。如果用福尔马林作陈列标本的固定液，则因为福尔马林含有 杂质较多，液体容易酸化，时间一长，会逐渐变为微黄*色或 淡黄*色，影响美观，影响陈列的效果。6）可与其它试剂配成多种的混合固定液，有时为了加快固定，常采用酒精和其 它试剂来配成混合固定液，这种固定液在固定的同时，兼有 对组织脱水的作用。应用酒精配成的混合固定液有：Carnoy氏固定液氯仿300ml冰醋酸100 ml95% 酒精 600 ml该固定液固定组织快速，在固定的同时兼有脱

22、水的作用。溶 液中的氯仿和酒精，对组织的收缩较厉害，但应用了冰醋酸， 这种现象便被中和去。AF固定液甲醛100 ml冰醋酸50 ml95% 酒精 850 ml这种固定液的作用与上液有相似之处，但要注意的是，凡使 用含有醋酸的固定液，其脱水用具不能使用铜制的脱水盒， 因冰醋酸跟铜离子起反应，生成醋酸铜，这种物质可沉淀于 组织间，可破坏组织中的抗原，造成免疫组化检测的失败。 应用时应多加注意。酒精也有许多不足之处， 它的缺点是：1）可溶解脂类物质， 凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精 的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片，因为酒精可将它 们溶解去，而石蜡切片组织中含有的脂类物质，

23、则在组织脱 水时被溶解去，只留下脂类或类脂物所占有的空间。2）对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。高浓度的酒精，对组织 有显著的收缩作用，造成组织发硬易脆，难以切片等现象。因此，它不作为单纯的固定液。3）渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定， 并形成了一层蛋白膜， 这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的 现象。4）可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定 的组织，核的染色都不好。5）可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须 脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微 镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，

24、 稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要 较快地通过低浓度的酒精， 以免使已着染的颜色被脱去。6) 价格较贵。从经济学的角度，应用酒精固定组织划不来，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例标 本需要100ml计，可固定50例标本，而一瓶500ml的酒精， 即使配成80%酒精，也只能固定 6例标本，因此，若用酒精固定组织，其价格比用甲醛固定组织的要高 8倍。3、冰醋酸。冰醋酸为 无色透明的液体，易挥发，气味大，一打开瓶盖，整个文章 都可闻其味道，纯醋酸在17c时常为结晶状，因称为冰醋酸， 在冬天使用时，可用微波炉进行解冻，再行使用，它的优点 有：1)能迅速固定

25、染色质，助于染色，用醋酸配成的固定 液，具作用快，固定效果均匀，对于染色质的固定快，因此， 用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明矶苏木素和伊红时，常常需加入一定量的醋酸，以促进染色。2)能使组织尤其是富含纤维的组织膨胀。各种固定液对组织都有收 缩的作用，尤其是对富含纤维的组织。而它不但不会使组织 收缩，而且还会令许多组织发生膨胀的作用。根据这个特点，用它配成许多种不同的混合固定液，以达到固定好，收缩少,易切片，效果好等目的。用它配成的混合固定液有：1) Zenker氏固定液：重铭酸钾25G升汞50G蒸播水1000ml冰醋酸50ml先将重铭酸钾和升汞溶于水中，尢其是重铭酸钾，应用热水 或加

26、温的方法将其溶解，然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中， 如暴露于空气中，该溶液将会被慢慢氧化而使颜色加深，导 致失效。临用时，取贮存液 950ml ,加入50ml的冰醋酸， 即可使用。应用该固定液固定的组织，一般不要超过24h ,取由组织，流水冲冼12小时以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在 切片染色前，必须用碘除去汞盐的沉着。应用该固定液的组 织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示骨骼肌的 横纹时，应用本液可获得满意的结果，但由于其含有醋酸， 故不能用于保存细胞颗粒，红细胞及含铁血黄素。2) Flemming 氏液2%酸水溶液200ml1%铭酸水溶液 700ml冰醋酸100ml该液中的

27、奥酸对脂肪组织既有固定作用，又有染色作用，对 有髓神经纤维也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色， 该液不适合。应用该液固定的组织，切片不能太大过厚, 般1-2毫米厚固定时间1-3天，后经水洗，保存于 80%酒精 中，除上述两液体外，还有 Bouin氏液和Carnoy氏液等。 冰醋酸也有许多不足之处：1）不能作为单一的固定剂。冰 醋酸在实际应用中，常被作为添加剂来使用，如许多种固定 液，都加入了冰醋酸。另外，在苏木素和伊红染液中，也常 加入了冰醋酸。2）不能凝固蛋白质，不能保存白细胞颗粒， 红细胞及含血铁黄素等。3）价格较贵。4、铭酸钾是一种固 体，粉末状，桔红色，具有毒 性，较难溶解于凉水

28、，因此 在配制时用较高温度的水来溶解，也较易发生沉淀。它的优 点是：1）能固定脂肪及类脂物。2）为髓鞘及嗜铭细胞优良 的媒染剂。3）可配成多种的混合固定液（1） Helly 氏液重铭酸钾25g升汞50g蒸播水1000ml甲醛50ml临用时加入甲醛，因其加入后于24小时后可发生沉淀而失效，因用时应特别注意。该液是白细胞颗粒的优良固定剂，因此凡为白细胞或造血器 官如骨髓，脾脏及患先天性梅毒之肝脏等，可用此液固定。 此液原配方要求加入硫酸钠，但据我们经验认为，硫酸钠在 液中对组织无任何作用，故省去。（2） Orth 氏液重铭酸钾20g蒸播水1000ml甲醛100ml该液固定组织较缓慢，不适合于作临床

29、的活检固定液，4毫米厚的组织固定时间需 36-72小时，该液对于染色质的固定 好，显示清晰，但可溶解部分红细胞和含铁血黄素。重铭酸钾的不足之处有：1）不能沉淀蛋白质，它必须和醋 酸配成混合固定液，方能发挥作用，产生铭酸，沉淀蛋白质。2）具有毒性及产生高温。在配制液体时，如清洗剂，当加 入硫酸时，可产生很高的温度，并挥发由刺鼻的气体，应特 别注意。3）它不能长期固定组织，经它固定的组织应充分 水洗后保存于80%酒精中。5、氯化汞又称升汞，具有毒性。 单独用于固定组织，对组织有较大的收缩力，故很少单独使 用。它可使组织蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，这是 由于它穿透力极弱所致，因此它不适合固定较

30、厚的组织。它 常与其它的试剂配成混合固定液，彼此抵消各自存在的不足， 使固定组织的效果非常好。应用升汞配成的固定液的优点有：1）细胞核及细胞浆染色清晰。 2）对白细胞颗粒，造血器官 如骨髓和脾脏等是优良的固定剂。 3）可配成许多混合固定 液如：Zenker氏、Helly氏和Stieve氏等。它的不足之处是：1）容易产生汞盐沉淀。经升汞配成的混 合固定液固定的组织，一是不能固定太长时间，经 24h后冲 水，然后保存于70%或80%的酒精中，二是在洗色前，都 必须用碘除去汞盐的沉淀，以免由于汞盐沉淀在切片上而影 响对切片的观察。2）对组织有较大的收缩力且穿透力弱， 用它不能固定过厚的组织，因穿透力弱，组织中间部分固定 不好。3）具有毒性。五、微波辐射固定组织组织固定的结 果是组织中的蛋白质凝固，以保存组织中原有的微细结构。常规固定用的是甲醛或酒精等。但是这