DNA提取与鉴定2‘

1、植物组织的植物组织的提取与鉴定提取与鉴定 张萍萍张萍萍分离纯化核酸原则与要求分离纯化核酸原则与要求1. 1.应保证核酸一级结构的完整性应保证核酸一级结构的完整性 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求要求) ) 2.2.排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度； 无其他核酸分子

2、的污染，例如提取无其他核酸分子的污染，例如提取DNADNA分子时，应去分子时，应去除除RNARNA分子分子3.3.减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解 避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在作多在pH 4pH 41010条件下进行条件下进行4. 4. 减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解 强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性能明显破坏大分子量

3、的线性DNADNA分子对于分子量小分子对于分子量小的环状质粒的环状质粒DNADNA及及RNARNA分子，威胁相对小一些分子，威胁相对小一些 。5. 5. 防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解 细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。酸的一级结构。DNADNA酶需要酶需要MgMg2+2+，CaCa2+2+的激活，因此的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTAEDTA，柠檬酸盐，柠檬酸盐，可基本抑制可基本抑制DNADNA酶的活性酶的活性 RNARNA酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸

4、酶不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失去活性，所以生物降解是碱，不易失去活性，所以生物降解是RNARNA提取过程的提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织主要危害因素。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮或一液氮或一7070的冰箱中。的冰箱中。DNADNA在细胞内的分布在细胞内的分布n核酸包括核酸包括DNADNA、RNARNA两种分子，在细胞两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。中都以与蛋白质结合的状态存在。n真核生物的染色体真核生物的染色体DNADNA为双链线性分

5、子，为双链线性分子，原核生物的染色体原核生物的染色体DNADNA、质粒及真核细、质粒及真核细胞器胞器DNADNA为双链环状分子；有些噬菌体为双链环状分子；有些噬菌体DNADNA为单链环状分子；为单链环状分子； 9595的真核生物的真核生物DNADNA主要存在于细胞核内，主要存在于细胞核内，其他其他5 5为为细胞器细胞器DNADNA，如线粒体、叶绿体等，如线粒体、叶绿体等 RNARNA分子主要存在于细胞质中，约占分子主要存在于细胞质中，约占7575，另有，另有1010在细胞核中，在细胞核中，1515在细胞器中。在细胞器中。 大多数生物体内大多数生物体内RNARNA分子均为单链线性分子并具有不同分

6、子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物的结构特点，如真核生物mRNAmRNA分子多数在分子多数在3 3端带有端带有polyApolyA结构。结构。 DNADNA的性质的性质 DNADNA是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱是很惰性的化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基堆积基对外侧受磷酸和糖的保护，并由于其内部的碱基堆积力而进一步加强，使力而进一步加强，使DNADNA在细胞内比其他成分更具化在细胞内比其他成分更具化学耐久性。学耐久性。 因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，因此在氯仿等使蛋白质变性的条件下，DNADNA分子仍然稳定。分子仍

7、然稳定。 真核生物中的染色体真核生物中的染色体DNADNA与碱性蛋白与碱性蛋白( (组蛋白组蛋白) )结合而成结合而成核蛋白核蛋白(DNP)(DNP)形式而存在于核内。形式而存在于核内。 DNADNA在乙醇中形成絮在乙醇中形成絮状沉淀，使状沉淀，使DNADNA最终得以分离最终得以分离真核生物基因组真核生物基因组DNADNA分离纯化的基本步骤分离纯化的基本步骤 真核生物的一切有核细胞真核生物的一切有核细胞( (包括培养细胞包括培养细胞) )都可以用来都可以用来制备基因组制备基因组DNADNA。提取方法包括两步：。提取方法包括两步： 1 1、先温和裂解细胞及溶解、先温和裂解细胞及溶解DNPDNP，

8、再使核蛋白解离，再使核蛋白解离，释放出释放出DNA.DNA. 真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波破碎法、匀浆真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波破碎法、匀浆法、法、液氮破碎法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶低渗法等物理方法及蛋白酶K K和和去污剂去污剂温和处理法，为获得大分子质量的温和处理法，为获得大分子质量的DNADNA，一般多采用后者，一般多采用后者温和裂解细胞。温和裂解细胞。高分子质量高分子质量DNADNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，长而弯在物理上仍是易碎的，在溶液中，长而弯曲的曲的DNADNA分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸 基团间基团间的

9、静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引的静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组DNADNA容易成片容易成片断获取，但所需分子质量越大，获得的难度也相应增加，断获取，但所需分子质量越大，获得的难度也相应增加，大于大于150 kb150 kb的的DNADNA分子在常规分离方法中多被切断。分子在常规分离方法中多被切断。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNADNA链机链机械剪切机会较多，因此有人使用械剪切机会较多，因此有人使用8080甲酰胺解聚核蛋白联甲

10、酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得小于合透析的方法，可得小于200 kb200 kb的的DNADNA片段。片段。 RNaseRNase消化去除消化去除RNARNA2. 2. 采用化学或酶学方法去除蛋白质、采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNARNA及其及其他大分子他大分子小麦基因组小麦基因组DNADNA提取与鉴定提取与鉴定实验目的实验目的1学习植物基因组学习植物基因组DNA提取的原理。提取的原理。2熟悉并掌握基因组熟悉并掌握基因组DNA提取制备的基本技术。提取制备的基本技术。【实验原理实验原理】 脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）是一切生物细胞重要的组成）是一切生物细胞重要的组成成分，主要存在

11、于细胞核中，盐溶法是提取成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的的常规技术之一。与动物细胞相比，植物细胞富含多常规技术之一。与动物细胞相比，植物细胞富含多酚、黄酮和多糖等次生代谢产物，这些物质易与酚、黄酮和多糖等次生代谢产物，这些物质易与DNA共沉淀而影响其分离纯化。共沉淀而影响其分离纯化。 CTAB法是目前植物基因组法是目前植物基因组DNA提取的首选方法，提取的首选方法，CTAB (十六烷三甲基溴化铵十六烷三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，是一种阳离子去污剂，可使细胞膜破裂，并能与核酸形成复合物，在高盐可使细胞膜破裂，并能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（溶液中（0.5M NaCI）是可

12、溶的，通过离心使）是可溶的，通过离心使CTAB-核酸复合物与植物多糖等杂质相分离。核酸复合物与植物多糖等杂质相分离。核酸提取液中含有核酸提取液中含有的蛋白质、多糖等可以的蛋白质、多糖等可以用沉淀分离法除去。用沉淀分离法除去。在核酸提取液中加在核酸提取液中加入氯仿入氯仿- -异戊醇或氯仿异戊醇或氯仿- -辛醇，振荡一段时间，辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿一水界使蛋白质在氯仿一水界面上形成凝胶状沉淀而面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在离心除去，核酸仍留在水溶液中。水溶液中。 核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中加入亲水有机溶剂（乙醇或异丙醇），使加

13、入亲水有机溶剂（乙醇或异丙醇），使DNADNA或或RNARNA呈絮状沉淀析出。而呈絮状沉淀析出。而CTABCTAB因溶因溶于乙醇或异丙醇而除去。于乙醇或异丙醇而除去。 植物基因组植物基因组DNADNA提取的另一种常用方法是提取的另一种常用方法是SDSSDS提取法，提取法，SDSSDS（十二烷基硫酸钠）是强去（十二烷基硫酸钠）是强去污剂，可使细胞膜及核膜破裂，同时也是一污剂，可使细胞膜及核膜破裂，同时也是一种强的蛋白变性剂，使蛋白质变性，与核酸种强的蛋白变性剂，使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中提取出分离，从而从材料中提取出DNADNA。 【实验材料实验材料】1 1材料材料小麦叶片小麦叶片2

14、 2器材器材研钵，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，离心管，液氮罐研钵，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，离心管，液氮罐 3 3试剂试剂(2(2人人/ /组组) ) (1) 1mol/L TrisHCl(1) 1mol/L TrisHCl缓冲液缓冲液(pH 8.0)(pH 8.0)：12.1g Tris12.1g Tris溶于溶于80mL80mL重蒸水中，用浓盐酸调节重蒸水中，用浓盐酸调节pHpH至至8.08.0，用重蒸水定容，用重蒸水定容至至100mL100mL。 (2) 0.5mol/L EDTA(2) 0.5mol/L EDTA缓冲液缓冲液(pH 8.0)(pH 8.0)：取：取18.61g EDT

15、A-18.61g EDTA-Na2H2ONa2H2O用重蒸水用重蒸水80mL80mL溶解，然后用溶解，然后用NaOHNaOH调节调节pHpH至至8.08.0，加重蒸水至，加重蒸水至100mL100mL。 (3) PVP-10(3) PVP-10(聚乙稀吡咯烷酮聚乙稀吡咯烷酮) )【实验材料实验材料】3 3试剂试剂(2(2人人/ /组组) )n(4)(4)氯仿氯仿- -异戊醇溶液异戊醇溶液(24:l ,V/V) (24:l ,V/V) ，现配现用。，现配现用。n(5) 70%(5) 70%乙醇乙醇n(6) 1(6) 1TETEn(7)(7)无水乙醇或异丙醇无水乙醇或异丙醇n(8) RNase A

16、(8) RNase A (9) CTAB(9) CTAB提取缓冲液提取缓冲液(100ml)(100ml)1M Tris HCl (pH8.0) 10ml1M Tris HCl (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10mlNaCI 3.27gNaCI 3.27gPVP-10 1.0gPVP-10 1.0gCTAB 2.0gCTAB 2.0gddHddH2 2O O 定容至定容至 100ml100ml6565溶解，使用前加巯基乙醇溶解，使用前加巯基乙醇2ml2ml。【实验材料实验材料】 (10) SDS(10) SDS提取缓冲液提

17、取缓冲液(100ml)(100ml)1M Tris HCl (pH8.0) 10ml1M Tris HCl (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10ml0.5M EDTA (pH8.0) 10mlNaCI 2.92gNaCI 2.92g偏重亚硫酸钠偏重亚硫酸钠 0.380.38SDS 1.25gSDS 1.25gddHddH2 2O O 定容至定容至 100ml100ml6565溶解，使用前加巯基乙醇溶解，使用前加巯基乙醇2ml2ml。【实验材料实验材料】【实验方法实验方法】1 1取取30ml30ml离心管中，加入约离心管中，加入约8ml SDS8ml SDS提取提取缓

18、冲液，水浴锅中预热至缓冲液，水浴锅中预热至6565，取，取2 24g4g新鲜叶片于研钵中，加人液氮充分研磨新鲜叶片于研钵中，加人液氮充分研磨成粉末，移入成粉末，移入30ml30ml离心管中（样品的量离心管中（样品的量为提取液量的为提取液量的1/2-2/31/2-2/3） 。充分混匀，置。充分混匀，置6565水浴水浴1h1h。每隔。每隔10-1510-15分钟摇匀一次。分钟摇匀一次。 2. 2. 取出，冷却至室温，加入取出，冷却至室温，加入等体积的氯仿等体积的氯仿- -异戊醇溶液异戊醇溶液(24:l ,V/V) 12mL(24:l ,V/V) 12mL，上下剧上下剧烈振荡烈振荡1- 1-2min

19、2min （互溶即（互溶即可），可），使组蛋白分离，于使组蛋白分离，于4000r/min4000r/min，离心，离心l5minl5min，吸，吸出上面含有出上面含有DNADNA的水层，的水层，弃去两层间的变性蛋白凝弃去两层间的变性蛋白凝胶，回收下层有机相。胶，回收下层有机相。【实验方法实验方法】 3. 3. 将上清液转入另一将上清液转入另一30ml30ml离心管中，在上清液中加入离心管中，在上清液中加入2 2倍倍体积冰无水乙醇或异丙醇，轻缓颠倒混匀，出现絮状沉体积冰无水乙醇或异丙醇，轻缓颠倒混匀，出现絮状沉淀，淀， -20-20放置放置30min30min或或-80-80放置放置10min1

20、0min。 4 4用枪头钩出用枪头钩出DNADNA或或4000 r/min4000 r/min离心离心15 min15 min，去上清液，去上清液，回收回收DNADNA沉淀。沉淀。 5 5沉淀用沉淀用7070乙醇洗涤乙醇洗涤1 1次。转移至次。转移至2mL EP2mL EP管中，晾干管中，晾干或在超净工作台上吹干。或在超净工作台上吹干。 6 6吹干的吹干的DNADNA溶于适量的溶于适量的 TETE（0.2-1ml0.2-1ml）缓冲液中，完）缓冲液中，完全溶解后加入全溶解后加入10l RNase A10l RNase A，3737保温保温30 min30 min消化消化RNARNA。【实验方法

21、实验方法】【注意事项注意事项】 1 1研磨好的植物材料细粉末在转入离心管之前不要让它研磨好的植物材料细粉末在转入离心管之前不要让它融化。融化。 2 2提取过程中机械力可导致大分子提取过程中机械力可导致大分子DNADNA的断裂，为保证的断裂，为保证DNADNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。液的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。液氮研磨时，不宜过于剧烈；氮研磨时，不宜过于剧烈；除去蛋白质时，若振荡剧烈可除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分使部分DNADNA断裂，乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的断裂，乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的纤维状纤维状DNADNA外，溶液中还会有絮状沉

22、淀，即为断裂的外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂的DNADNA。但若振荡不够，蛋白质不能很好除去，则影响。但若振荡不够，蛋白质不能很好除去，则影响DNADNA制品的质量。制品的质量。 3. 3. 为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，使其分子断为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，使其分子断裂，因而不能获得天然的大分子核酸。提取中需要加人裂，因而不能获得天然的大分子核酸。提取中需要加人EDTAEDTA、柠檬酸钠柠檬酸钠、8- 8-羟基喹啉等羟基喹啉等抑制核酸酶的活力抑制核酸酶的活力，并，并在在低温低温下进行操作，此外提取过程中应避免加热，强酸，下进行操作，此外提取过程中应避免加热，强酸，强碱和

23、剧烈振荡等。强碱和剧烈振荡等。 4 4CTABCTAB或或SDSSDS溶液在低于溶液在低于1515时会析出沉淀，因此在时会析出沉淀，因此在加入冷冻的植物材料前必须预热，离心温度也应保持不加入冷冻的植物材料前必须预热，离心温度也应保持不低于低于1515。 5 5植物组织由于多酚类化合物含量较高，会使溶液出现植物组织由于多酚类化合物含量较高，会使溶液出现褐变现象，如果材料中色素物质特别多，可适当提高抽褐变现象，如果材料中色素物质特别多，可适当提高抽提缓冲液中的巯基乙醇浓度至提缓冲液中的巯基乙醇浓度至2%2%5%5%，或增加，或增加PVPPVP的用的用量至量至2%2%；多糖含量太高的材料，可在使用前

24、将组织冷藏；多糖含量太高的材料，可在使用前将组织冷藏或冷冻保存。或冷冻保存。 为避免大分子为避免大分子DNADNA的断裂，枪头在使用前需圆口。的断裂，枪头在使用前需圆口。【注意事项注意事项】思考题1. 1.为什么在低温下进行？为什么在低温下进行？2. 2.加加EDTAEDTA或柠檬酸钠的作用或柠檬酸钠的作用 ? ?3. 3.加入异戊醇有什么作用？加入异戊醇有什么作用？4. 4.分离纯化过程中每一步试剂的作用？分离纯化过程中每一步试剂的作用？l实验室：实验室： 207室室 209室室l领用仪器：领用仪器： 211室室l纯水机：纯水机： 207室室 209室室l离心机：离心机： 209室一台室一台

25、 103室一台室一台l分光光度计室：分光光度计室：108室室DNA的鉴定与分析紫外吸收法测定紫外吸收法测定DNADNA纯度和含量纯度和含量琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA分子大小分子大小与完整性与完整性DNA的鉴定与分析紫外吸收法测定紫外吸收法测定DNADNA纯度和含量纯度和含量琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA分子大小分子大小与完整性与完整性二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定DNADNA含量含量紫外吸收法测定紫外吸收法测定DNADNA纯度和含量纯度和含量核酸在核酸在260nm260nm波长处具有紫外吸收特性波长处具有紫外吸收特性( (最大吸收峰最大吸收峰) )。此

26、法快速、。此法快速、简便，且不破坏样品，是定量测定浓度较高的纯简便，且不破坏样品，是定量测定浓度较高的纯DNADNA和和RNARNA溶液溶液的首选方法。的首选方法。高纯度高纯度DNADNA制品的制品的260nm260nm与与280nm280nm的吸光值的比值在的吸光值的比值在1.81.8左右左右，当，当比值偏高时表明制品中混杂有比值偏高时表明制品中混杂有RNA,RNA,而比值偏低时则表明制品中可而比值偏低时则表明制品中可能有蛋白质或酚的污染。能有蛋白质或酚的污染。因此，可利用因此，可利用A260/A280A260/A280比值的测定来鉴定比值的测定来鉴定DNADNA制品的纯度制品的纯度。【实验

27、原理实验原理】1 1取取DNADNA溶液溶液2ul2ul，用，用0.010.01mol/Lmol/L的氢氧化钠溶液定容至的氢氧化钠溶液定容至300ul300ul，转入，转入0.5mL0.5mL的石英比色杯中。的石英比色杯中。2 2用用300ul 300ul 0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH校正紫外分光光度计的零点。校正紫外分光光度计的零点。3 3在在260nm260nm，280nm280nm处分别读出吸光度值处分别读出吸光度值(A)(A)。定量分析：定量分析：DNADNA的浓度的浓度=A260=A260核酸稀释倍数核酸稀释倍数505010001000 =A260 =A2

28、60150150505010001000 =7.5 =7.5A260(g/l)A260(g/l) RNA RNA的浓度的浓度=A260=A260核酸稀释倍数核酸稀释倍数40401000 (g/l)1000 (g/l)【实验步骤】 分光光度换算：分光光度换算： 1A2601A260双链双链DNA=50g/ml DNA=50g/ml 1A2601A260单链单链DNA=30g/ml DNA=30g/ml 1A2601A260单链单链RNA=40g/mlRNA=40g/ml 注意 将DNA样品稀释到A280在0.2-0.8（0.1-1.0）之间再测A260、A280及计算A260/A280比值，因为

29、只有在此范围内才有线性关系，可先用原液测定，再估算稀释比例。4 4纯度分析：纯度分析：若为若为DNADNA纯品，则纯品，则A260A260A280=1.8A280=1.8 若为若为RNARNA纯品，则纯品，则A260A260A280=2.0A280=2.0 若若DNADNA样品样品A260A260A2801.8A2801.8，说明仍有，说明仍有RNARNA，可用，可用RNARNA酶处理酶处理样品；若样品；若A260A260A280l.7A280l.7，说明样品中存在蛋白质，应再用酚，说明样品中存在蛋白质，应再用酚/ /氯仿抽提，乙醇沉淀纯化氯仿抽提，乙醇沉淀纯化DNADNA。 若为若为RNAR

30、NA样品样品A260A260A2802.0A2802.0，也应考虑再用酚，也应考虑再用酚/ /氯仿抽提。氯仿抽提。 若核酸样品若核酸样品A260A260A2302.0A23010V/cm)(10V/cm)，所以选择一个有，所以选择一个有相对较大的缓冲槽比较有利。相对较大的缓冲槽比较有利。【注意事项注意事项】二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定DNADNA含量（三）含量（三） 强酸、加热条件下，可以使强酸、加热条件下，可以使DNADNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖脱氧核糖与嘧啶核苷酸。与嘧啶核苷酸。 其中其中22

31、脱氧核糖在酸性环境中成为脱氧核糖在酸性环境中成为羟基羟基酮基戊醛，酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成此物与二苯胺反应生成蓝色化合物蓝色化合物，在，在595595nmnm处有最大吸收。处有最大吸收。DNADNA在在40-40040-400g/mlg/ml范围内光密度与范围内光密度与DNADNA浓度成正比。浓度成正比。 在反应液中加入在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干，而且其他化合物的干扰也显著降低。扰也显著降低。 当样品含少量当样品含少量RNARNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有

32、色物质，干扰测定。物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。【实验原理实验原理】1 1、DNADNA标准溶液：标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准（须经定磷法确定其浓度）取标准DNADNA以以0.010.01mol/L NaOHmol/L NaOH配成配成200200微克微克/ /毫升的标准液。毫升的标准液。 每组需每组需1212.4ml.4ml，200ml/200ml/班班2 2、待测样品液：待测样品液：取取DNADNA溶液？溶液？ul ul，用，用0.010.01mol/Lmol/L的氢氧化的氢氧化钠溶液定容至钠溶液定容至5ml5ml配成配成100100微克微克/ /毫升的

33、溶液。毫升的溶液。 每组需每组需7ml7ml3 3、二苯胺试剂：、二苯胺试剂：1g1g二苯胺二苯胺 （需在（需在70%70%乙醇试剂中重结晶乙醇试剂中重结晶2 2次次) ) +100 mL+100 mL冰乙酸冰乙酸+10 mL+10 mL过氯酸，混合备用，过氯酸，混合备用，临用前加临用前加入入1.0 mL1.6%1.0 mL1.6%乙醛。乙醛。 每组需每组需64ml,1000ml/64ml,1000ml/班班4 4、1.6%1.6%乙醛：乙醛：取取47%47%乙醛乙醛3.43.4mlml，加重蒸水定容至加重蒸水定容至100100mlml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。放于冰箱中，一周之内可以使用）。注意：商品用有注意：商品用有47%47%和和4 40%0%两种两种 1. 1. DNADNA标准曲线的制定：标准曲线的制定： 取取1 14 4支试管，分成支试管，分成2 2组，依次加入组，依次加入0 0、0.20.2、0.40.4、0.80.8、1.21.2、1.61.6和和2.02.0mlDNAmlDNA标准溶液。