生物酶工程复习整理

1、生物酶工程主要研究内容（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）如：酪氨酰tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。生物酶工程示意酶工程原理和基本过程菌种一扩大培养一发酵一发酵酶液一酶的提取一酶成品原料一前处理一杀菌一酶反应器一酶的固

2、定化反应液一产品提取一产品世界三大酶制剂公司NovoNordisk（丹麦）Genenco门nternational（美国杰能科国际公司）Cuitor（芬兰）三大公司销售额占世界总额的70%2、米氏常数的意义Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率Vmax一半时底物的浓度，单位与底物浓度同(1) Km是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。当底物确定,反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。Km一般在1X10-610-1mol/L之间不同白酶Km值不同，测定Km要在相同测定条件(pH、温度、离子强度)下进行。(2) Km值可用于判断酶的专一性和天然产物

3、，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。(3)可近似表示酶与底物亲和力的大小。真正表示酶与底物亲和力为Ks=k2/k1(注Km=k2+k3/k1)(4)已知Km可由S计算v,或由v计算S。酶活力是指一定条件下，酶所催化的反应初速度；酶催化反应速度用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。V=-dS/dt=dP/dt二、酶的活力单位：表示酶活力大小所用的两个国际单位?1IU:在最适反应条件下,每分钟催化1科mol底物转化为产物所需的酶量，称一个IU。?1Kat：在最适反应条件下,每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位1Kat

4、=6X10IU;1IU=1/60科Kat16.7nKat?最适条件：最适温度，最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度要求：(1)通常很大，使酶饱和；(2)底物消耗w5%。前的生产方法提取分离法(Extract i on生物合成法(B i osynthes i s)化学合成法(chemi ca I synthes i s)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin*PancreaAmylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from

5、 AspergillusFew exampleorgan/tissue/cellPlant cell culture Animal cell culture试管菌种培养,I.茄瓶国种培养摇瓶菌种培养抱子(菌体)悬液制备种子罐菌神培养-发酯罐发酪发酯液预处理酶的分离纯化精制目前工业用酶大多数来自微生物。经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞的生命活动获得所需酶的技术过程称为酶的发酵生产。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。酶发酵生产的前提之一：选育到性能优良的产酶微生物！对产酶微生物的要求：(1)产酶量高；(2)易培养和管理；(3)产酶性能稳定；(4)利于酶产品的分离纯化；(5)安全可靠、无

6、毒性等。I960,Jacob和Monod提出的操纵子学说阐明；与生物合成相关的四个基因：调节基因Regulatorgene;启动基因Promotergene;操纵基因Operatorgene;结构基因Structuralgene;调节基因(R):可产生一种变构蛋白，通过与效应物(effector)(包括诱导物和辅阻遏物)的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。启动基因(P)(启动子)：有两个位点：(1) RNA聚合酶的结合位点(2) cAMP-CAP的结合位点。CAP:分解代谢物活化剂蛋白，又称环腺甘酸受体蛋白(cAMP receptor prote

7、in , CRP)。操纵基因(Operatergene):位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因(Structuralgene):决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA,再翻译为蛋白质。酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏L酶合成的诱导作用加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为诱导作用.诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。例：乳糖诱导耳半扎糖甘晦的合成淀粉，导淀粉晦的合成2.酶合成的阻遏(1)终产物阻遏X指酶催化反应的产物或代谢途径A的末端产物使该睥的生物合成

8、受到同飘蜘爵会阻遏催化色鼠酸合成的相关传(2)分解代谢物阻遏AB是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻1遏藐他麻合城的蛹熊舞的生物合成|.BrI黑箱用谓金小粉眸岭生物合属小结:影响酶生物合成模式的主要因素：培养基中阻遏物的存在和mRNA的稳定性。(1)不受培养基中某种物质阻遏时，可随着细胞生长而开始合成；受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。(2)mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。选择与改造选择：在的的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发醵周期，最理想的合成模式是延续合成型。次迨非理想模式：在细胞

9、选育上下功夫，并适当调节工艺条件.(1)同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。(2)中期合成型：要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力。(3)滞后合成型在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。酶发醒生产的一般工艺流程图1.动物细胞培养的特点?细胞生长速度慢。（需添加抗生素）?细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。?反应过程成本高，产品价格贵。?细胞具有锚地依赖性。?原代细胞一般繁殖50代。二,分离纯化的一般流程原料液I细胞分离（离心、过滤）线路1J一路2II细胞（胞内产物）清液（胞外产物）I细胞破碎I碎片分离相务离纯化成品化首先

10、,应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的了解；叵，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力回收率和纯化倍数为指标；再者,在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件；最后,要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降，酶更不稳定，因此，更要防止酶变性。（二）酶分离纯化应注意以下问题1、防止酶变性失活：热、pH、泡沫、重金属等。2、选择有效的纯化方法。3、酶活性测定应贯穿纯化过程的始终。第二节提取指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的抽提。（-）抽提方法四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂，水心（二）抽提

11、过程中的注意事项hpH值；选择的pH值不超出海的磷碱稳定范围；最好远离待抽提商的等电点口2 .温度；通常控制在卜10C左右，尤其是采用有机溶剂提取时。a.抽提液体税（用量）抽棍液的用量一般为含瘴京料体根的25倍“可一次抽提，也可分几次反咬抽提U4 .为梃高翦的熄定性，可以加入适量的保护剂。（三）膜的使用性能<1>透水率（透水通量.流率）；，是指在一定温度和压力条件下单位膜面积在单位时间内透过的水量口,处理蛋白质（萌）溶液时，透水率常为纯水的10%。I（2）截留率：，是指溶液中某一溶质被膜截留量的百分数口|，解超滤浓缩通常选用90%以上截留率的膜“（3）截留物相对分子质量;,是指某种

12、大分子如箭，在截智率达到某一指标情况下的被截留物的分子量。2 .密度梯度离心在离心管中用560%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密建梯度溶液中形成若干条不连续的区带。梯度介质：蔗糖密度梯度系统3 .等密度梯度离心当欲分禽的不同颗桎的身度范围处于离心介质的密度范围时,在离心力的作用卜，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他，们雀百的浮力密度恰好相等的位置，形成区带2常用的离心介质;钠盐，illCsCbCs2SO4,CsBr先把一定浓度的葩盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量的葩盐加到样品液中使之溶解。在选定的离心

13、力作用下，经过足够时间的离心分离。葩盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度梯度。样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成区带。茴定相材料的准备装柱平衡上样（洗涤和）洗脱|收集洗 |脱液洗脱液检测，绘制洗脱曲线亲和层析法纯化胰蛋白酶鸡蛋清Sepharose4B猪胰脏III提取1 活化提取分离纯化III纯卵粘蛋白(CHOM)><活化Spharosc4B胰蛋白酶原粗提液II偶联激活CIIOM-Spharosc4B胰蛋白磬提取液I亲和层析纯胰蛋白酶I吸附层析离子交换层析凝胶层析亲和层析固定相物理吸附剂，如活性氧化铝磷酸钙胶体等离子交换凝胶离子交换纤维素离子交换树脂前

14、聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶(凝胶网孔内水为固定相)用琼脂糖或纤维素为载体共价结合适当的配基而成亲和吸附剂操作步骤特殊点无纤维素和凝胶类交换剂装柱时先抽气，柱床要再生后再1.样湿凝胶抽气后湿法装柱上样后先洗涤除杂质然后洗脱，柱床要再生洗脱特点洗脱液离子强度比样品液高常用pH梯度或盐浓度梯度洗脱用样品和平衡缓冲液洗脱洗脱液含酹的配基或其他物质应用醒分离纯化成本较低离子交换纤维素洗脱条件较温和，海分离纯化多用广泛用于能分离纯化、脱盐、测定相对分子质量筋纯化效率高但制备亲和吸附剂较麻烦，贵（+）高pH(+ )(-)MpH2 .PAGE的应用类型不连续page（用于一般分析分离纯化）4常规PAGE

15、-连续PAGE（同上）,浓度梯度PAGE（用于测定Pr相对分子质量和分离纯化）1SDS-PAGE（用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳）3 .不连续PAGE的特性和分离Pr的效应（1）三个不连续凝胶浓度不连续；pH值不连续；缓冲液不连续。（2）三种效应浓缩效应；电荷效应；分子筛效应。1、等电点聚焦电泳分离Pr原理等电点聚焦电泳是在电泳介质中加入两性离子载体，电泳时形成由阳极到阴极的连续递增的pH梯度，蛋白质按其电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离的电泳技术，无论Pr从正极出发或是从负极出发，都会聚焦在等电点处。超临界流体是指超过临界温度与临界压力状态的流体(2)超

16、临界CO2萃取的优点可以在接近室温下进行提取，有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散。CQ是一种不活泼的气体，萃取过程中不发生化学反应，且属不燃性气体，无味，无毒，安全性非常好。CO2气体价格便宜，纯度高，容易制取，且在生产中可以重复循环使用，从而有效地降低了成本。分离工艺流程简单。萃取效率高，过程易于调节。(1)等温变压流程等温法T1=T2,P1>P2(2)等压变温流程等压法T1<T2,P1=P2(3)等温等压吸附流程吸附法T1=T2,P1=P2(4)添加惰性气体的分离法流程2,结晶“三步曲安第一步：形成过饱和溶液稍微越过饱和状态，处于介稳态，浓缩、降温(少有升温)>调节pH至

17、pl，可使溶液趋于过饱和©第二步：形成晶核过饱和溶液在一定条件下可形成极微小的有序排列的固相物，成为后续晶体生长的核心，称为晶核.振荡、搅拌、快速降温可促使过饱和溶液形成晶核，有时可投入少量“晶种”微粒.第三步：晶体生长溶质在晶核周边不断有序排列，晶体逐步长大控制条件，如缓慢搅拌、适当升温使细小晶体溶解，溶质到大晶体周围集结生长°酶分子修饰的意义提高酶的活力增强酶的稳定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响蛋白质工程的主要步骤K新蛋白质工程结构的设计2、突变基因的核甘酸序列的确定(1)先测定酶的一级结(2)

18、用X射线衍射分析测定其三维结构7(3a)根据结构信息选择突变部位，即选定哪一个敏基酸残基要被取代;选4T)个氨基酸残基的寡肽序列,其间含待取代的氨基酸残基(3b)用化学法合成由1218个碱基组成并为所选寡肽的基基酸序列编码的核甘酸序列，作为定位诱变的引物(4)找到(构建)单股质粒，含有为所要蛋白质编码的基因,作为定点突变的模板.(5)将引物与单链模板DNA配对,用各种DNA聚合酶和DNA连接酶将引物延长,形成互补链,得到共价闭合的双链DNA,也叫异质双链质粒(6)将异质双链质粒引入宿主细胞，(如E.coli).转化为两个同质双链质粒，一个含的基因是天然蛋白质编码的，另一个是为突变体编码的(7)

19、将这两个基因分离并克隆，最后产物是细胞转化突变型，能合成突变体蛋白质，与母体蛋白质仅有1个氨基酸的差别，这个氨基酸就是事先选定的突变部位.抗体酶（abzyme）：是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，也叫催化抗体。特点：1、反应专一性相当于或超过自然酶反应的专一性，2、催化速度有的可达到自然酶催化的水平。但一般来说比非催化反应快102106倍，比天然酶催化反应速度慢，仅为它的10-4-10-2。翻生产一的的颗T籁分离靴制懈排脂直接利用制成雕演（或雕 倦睡）后利用用于断就用于加工加生 产一些产品用于睡瞬利水质牖界创用建

20、物工混其帆频枝酶制谶生产醐蒯脏?固定化酶的优点极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；较游离酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。?固定化酶存在的缺点固定化时，酶活力有损失；增加了生产的成本，工厂初始投资大；只能用于可溶性底物，而且适于催化小分子底物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；二、固定化酶的制备原则根据应用目的、应用环境，选择固定化的方法，都要遵循以下基本

21、原则：必须注意维持酶的催化活性及专一性。固定化应该有利于生产自动化、连续化。固定化酶应有最小的空间位阻酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低，以利于工业使用。酶传感器由生物识别元件和能量转换器相结合所构成的分析仪器。生物识别元件(Biologicalrecognitionelement)是酶经固定化后形成的一种生物敏感膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。换能器(Transducer)将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比

22、例关系。酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜：选择性地供别”并催化被检测物质发生化学反应；变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。固定化细胞的优缺点优点省去了酶的分离过程;增强酶的稳定性:有利于产品的分离纯化:对于多酶反应体系，无需辅因子再生缺点:，利用的仅是胞内醐;一细胞内多种酶的存在.会形成不需要的副产物;k细胞壁和膜阻碍底物和产物的渗透、扩散离子液(Ionicliquid)是由有机阳离子与有机(无机)阴离子构成的、在室温下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，稳定性好。以酶为催化剂进行反应所需的设备称为酶反应器。酶反应器基本上是游离酶、固定化酶或固定化细胞

23、催化反应的容器(附加有混合、取样和检测设备)。作用：酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物(原料)最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定产物。理想的反应器的要求生物反应器设计的主要目标：I使产品的质量最高，生产成本最低.评价生物反应器的主要标准：反应器生产能力的大丽产品质量的高低.所用牛物催化剂应具有较高的比活和酶浓度(或细胞浓度)才能得到较大的产品转化率.(2)能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件(3)应具有良好的传质和湖合

24、性能。传侦是指底物和产物在反应介质中的传递Q传质阻力是反应器速度限制的主要因素.(4)应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应罂的生产能力下降.反应器选择注意要点：(1)分子量较大-一般不采用膜反应器；(2)溶解度低，黏度高-选用搅拌罐式或流化床式;(3)底物为气体-鼓泡式(4)具有辅酶的反应-通常不采用膜反应器(5)适用性别足多种酶，多种条件(6)结构-简单(7)成本-低1、保持酶反应器的操作稳定性(11控制酶反应器中流动状态酶反应器动转中，反应器中不当流动方式的危害酶与底物接触不良，降低生产力。(2)发生程度不同的反应，使产物进一步反应，产生副反应。(3)压降加大，载体不规则及填充底物上柱不均匀，产生沟流或堵塞原因解决办法搅拌不均或过快，的分布不均出料口进料口过滤器互换填充床型中柱高和流速产生压降造成载体压缩使用较大的不可压缩的光的珠型填充材料均匀装填严控流速塞塞现象(固体或胶体物沉积妨碍了底物与酶接触)有外内壅塞间隔式填充，反冲床电新装柱通上行气流。底物高速循环，预