斑马鱼：在生命科学中畅游

1、 文章编号： 1004-0374(200605-0431-06斑马鱼: 在生命科学中畅游孙智慧，贾顺姬，孟安明*（清华大学生物科学与技术系，北京100084）摘要：模式动物是生命科学研究的重要材料，为生命科学的发展做出了重要的贡献。自20世纪90年代初以来，斑马鱼因其多方面的优点已成为模式动物家族中重要的一员，受到越来越多的重视和利用。目前，斑马鱼被广泛地用于发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研究，不断涌现新的研究成果。关键词：斑马鱼；模式动物中图分类号：Q959.468; Q95-33文献标识码：AZebrafish: swimming in life sciencesS

2、UN Zhi-Hui, JIA Shun-Ji, MENG An-Ming*(Department of Biological Sciences and Biotechnology, Tsinghua University, Beijing 100084, ChinaAbstract: Model animals have been widely used for studies in various aspects of life sciences. They have madeimportant contributions to advances in life sciences. Sin

3、ce the early 1990s, zebrafish has received more andmore attention because of its outstanding features. Now, zebrafish is extensively used as a vertebrate modelsystem in developmental biology, genetics, oncogenesis, pharmacology, toxicology and environmental science,with increasing scientific outcome

4、s.Key words: zebrafish; model animal1斑马鱼发展成为模式动物的历史斑马鱼(Danio rerio 是属于辐鳍亚纲(Actinop-terygii 鲤科(Cyprinidae 短担尼鱼属(Danio 的一种硬骨鱼。斑马鱼原产于印度东部、巴基斯坦、缅甸以及孟加拉国的小溪、稻田及恒河中游地区，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。20世纪70年代初，利用T4噬菌体研究遗传学的美国俄勒冈大学著名遗传学家George Streisinger注意到斑马鱼的优点，从宠物店购买了斑马鱼，开始研究其养殖方法、观察其胚胎发育过程、发展一

5、些收稿日期：2006-07-24相关的遗传学技术。近十年后，他的研究组于1981年在Nature 上发表了第一篇具有深刻影响的论文1。在这篇论文中，他们报导了斑马鱼的体外受精技术、单倍体诱导技术，建立了纯合品系，并介绍了斑马鱼的第一个自然突变体golden 。在其后的几年中，Streisinger 和他的同事先后报导了斑马鱼的卵裂特点、不同时期胚胎中细胞的发育命运等，并发现斑马鱼脑中的许多神经元的排列简单而有规律29。这些研究成果的报导，证明了斑马鱼适合用做模式动物，引起了许多发育生物学家的关注。20世纪90年代初，曾在果蝇上通过诱变研究作者简介：孙智慧(1970 ，女，博士研究生；贾顺姬(1

6、982 ，女，博士研究生；孟安明(1963 ，男，教授，博士生导师，*通讯作者。432生命科学第18卷阐明果蝇胚胎早期发育机理的德国发育生物学家Christine Nüsslein-Volhard，以及美国哈佛大学Wolfgang Driever博士的研究组同时开始对斑马鱼进行大规模化学诱变研究，到1996年他们共鉴定出约4000种斑马鱼突变体1011，为研究脊椎动物发育的分子机理储备了丰富的遗传资源，Development 专门于1996年用一期增刊发表了36篇相关论文。这些突变体的报道证明，斑马鱼是迄今适合用于饱和诱变的惟一的脊椎动物，因此在生命科学领域引起了极大的反响，在随后数

7、年中吸引了全世界大批实验室和科学家开始利用斑马鱼做模式动物，从此使其成为最重要的模式脊椎动物之一。2 斑马鱼的特点和优势斑马鱼的特点和优点主要体现在以下几个方面:2.1成年鱼个体小，易于饲养成年斑马鱼个体长约45cm ，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。一个盛3升水的鱼缸可养殖2030尾成鱼，因此在有限的空间可以养殖相当大的群体，可开展对样本需求量大的研究。2.2发育快速、性成熟期短、繁殖力强斑马鱼的胚胎发育很快，在28.5培养条件下受精后约40min 完成第一次有丝分裂，之后大约每间隔15min 分裂一次；24h 后，主要的组织器官原基已形成，各个脑室、眼睛、耳、血细胞、体节等均清楚可见，相当于28d

8、 的人类胚胎。在合适的养殖条件下，斑马鱼的性成熟期一般为3个月左右。雌雄鱼的交配行为受光刺激，可以通过调控光周期或控制雌雄鱼的接触而控制产卵时间。一尾雌鱼一般每次可产卵100300枚，每周可产卵一次。因此，利用斑马鱼做研究材料，可以保证每天获得成千上万的胚胎，这是用哺乳动物做研究材料所无法达到的，也是可用斑马鱼做饱和诱变和精确基因定位的原因。2.3胚胎体外发育，易于观察和操作斑马鱼体外受精，胚胎在母体外发育并且透明，因此易于观察。受精卵的直径约1mm ，易于进行显微注射和细胞移植等操作。2.4较完善的胚胎和遗传学操作技术在斑马鱼上可以像在低等模式动物，如线虫、果蝇上一样，很方便地进行细胞标记和

9、细胞谱系跟踪；也可像在爪蟾上一样做胚胎的细胞移植。此外，还可培育单倍体及基因组倍增。在基因功能研究方面，已发展了转基因技术、基因过量表达技术、利用反义寡核苷酸抑制基因表达的技术、随机及靶基因定向诱变的技术、体细胞克隆技术等。2.5基因组序列的注释即将完成斑马鱼基因组测序工作开始于2001年，主要由英国Sanger 研究所承担，目前已基本完成。斑马鱼有25对染色体/连锁群，已完成组装的序列总长度为1.63×109bp ，已注释的编码基因21503个、RNA 基因3421个(http:/vega.sanger.ac.uk/Danio_rerio/index.html。斑马鱼基因组序列的破

10、译极大地推动了功能基因组学的研究。2.6品系资源丰富目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为Tuebingen 品系、AB 品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tuebingen 。此外，保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。3目前利用斑马鱼开展的主要研究3.1基本生物学问题的解答生命周期涉及胚胎的发育、生长、生理和心理平衡的维持以及生殖细胞的产生、衰老、死亡，每一个过程都非常复杂，既接受基因的调控，也受到外界因素的影响，目前对这些生命过程的调控的了解还非常有限。斑马鱼的主要优点表现在高繁殖力、胚胎体外发育和透明

11、性，因此是研究胚胎发育的绝佳材料。在胚胎发育过程中，细胞的增殖、分化、迁移、凋亡共同作用，决定了个体的大小、形态和组织器官的形成，确定基因和基因间的相互作用对这些发育过程的影响是主要的研究方向。利用斑马鱼开展的胚胎发育研究主要包括以下方面：母体产生的因子(如蛋白质和mRNA 对启动胚胎发育的影响12、体轴的形成机制13、胚层的诱导与分化1416、胚胎中细胞的运动机制17、神经系统的发育1820、器官的形成2125、左右不对称发育26、原始生殖细胞的起源和迁移27等。利用斑马鱼寻求基本生物学问题的答案，在研究策略上大多涉及阻断基因的表达，主要是创造和利用突变体以及利用反义寡核苷酸。突变体是指使基

12、因组中的某个基因或某几个基因发生改变或丢失，因而不能合成相应的有正常功能的蛋白质或RNA ，导致胚胎或个体出现缺陷或死亡。从突变体中找出发生了改变的基因，就可以确认其生物学功能及其对其他基因的表达的影响。创造突变体的方法主要包括利用化学诱变剂ENU 随机诱变基因28，第5期孙智慧，等：斑马鱼: 在生命科学中畅游433ENU 诱变结合靶基因筛选的定向诱变29，利用反转录病毒插入随机阻断某个基因的表达30，利用转座子插入阻断某个基因的表达31。利用反义寡核苷酸阻断基因的表达，是人工合成可以与某个基因的mRNA 结合的吗啉环修饰的寡核苷酸，将其注射到胚胎中，它与该mRNA 结合后抑制从该mRNA 翻

13、译合成蛋白质32。由于注射到胚胎中的反义寡核苷酸随细胞的不断增加而使单个细胞中的含量逐渐下降，使其对基因表达的抑制作用逐渐减弱，因此该方法仅适于研究基因在胚胎发育期的功能。此外，基因的过量表达在基因功能研究中也发挥重要作用。在斑马鱼中的过量表达，一般是将人工合成的某个基因的mRNA 注射到胚胎中，使细胞中大量合成相应的蛋白质，由此可影响到一些发育过程，从而了解该基因的可能功能33。由于这种过量表达难以控制表达的时间和空间，许多情况下并不能真实地反映某个基因在特定发育程序中的作用。还值得一提的是，斑马鱼组织特异性转荧光蛋白基因技术的发展为研究组织器官的形成提供了极大的方便，成为活体组织解剖的强大

14、工具。该技术是利用只在某种组织或器官中表达的基因的启动子来控制绿色荧光蛋白(GFP基因或其他荧光蛋白基因的表达，从而标记出特定类型的细胞或组织器官34。获得的转基因胚胎和个体在紫外照射下将发出荧光，通过对活体胚胎和个体进行连续的观测，就可以直观地了解标记的组织器官的发生过程3538。这类转基因品系还可用作诱变的材料，较方便地筛选出影响被标记的组织器官的一系列突变体3940。3.2人类疾病模型及先导药物筛选人类的绝大部分疾病是由于基因异常引起的。斑马鱼属脊椎动物，其生长发育过程、组织系统结构与人有很高的相似性，两者在基因和蛋白质的结构和功能上也表现很高的保守性，因此斑马鱼是研究人类疾病发生机理的

15、优良模式动物。迄今已鉴定的一些斑马鱼突变体，其表型类似于人类疾病。例如，sauternes (sau 突变体表现为血细胞小、血红蛋白含量低的贫血，其突变的基因为负责合成胚胎红细胞血红素的d-氨基-g-酮戊酸合成酶基因ALAS-2，它类似于人类ALAS-2基因突变引起的先天性铁粒幼红细胞性贫血症41; 斑马鱼yqu 突变体因尿卟啉原脱羧酶(UROD基因缺陷而使成红细胞中积累过多的卟啉，表现为对光过敏，它与人的红细胞卟啉症类似42; gridlock 突变体不能形成正常的动脉血管而导致血液循环受阻，类似人类先天性动脉血管收缩症43; double bubble 突变体的表型类似于人类常染色体显性多

16、囊肾病的症状44，美国Hopkins 教授实验室鉴定了11种发生多囊肾的斑马鱼突变体45; fleer 和elipsa 突变体表现出肾、眼发育不良，类似于人类Senior-Loken 综合征44, 46; Mariner 和sputnik 突变体表现耳聋，类似发生耳聋的人Usher 综合征47; glass onion、nagie oko、oko meduzy、belladonna 等突变体是人视网膜变性病的模型48; sapj e 突变体是人类肌无力症的模型49。肿瘤是对人类健康威胁最大的疾病之一，近年的研究表明斑马鱼同样可以用来产生肿瘤模型。Langenau 等50通过在斑马鱼的胸腺中过量

17、表达小鼠的c-Myc 基因而制备出白血病的动物模型。在斑马鱼中将抑癌基因TP53突变后，易发生恶性周边神经鞘瘤51。b-myb 基因突变后的crash&burn(crb 突变体杂合体经MNNG 致瘤剂处理后，比野生型鱼更易发生血管瘤、睾丸生殖细胞瘤等肿瘤52。Moore 等53人通过诱变筛选表现基因组不稳定性的突变体，获得多种易于发生肿瘤的杂合突变体。斑马鱼具有个体小、养殖成本低的优点，成为可进行高通量药物筛选的惟一脊椎动物模型。利用突变体或转基因鱼，甚至野生型斑马鱼可较方便地进行小分子化合物的筛选，筛选出的化合物可用做进一步的临床测试。一般是将突变体胚胎或转基因胚胎放入含有某种化合物

18、的水溶液中培养，在此过程观察胚胎的表型或报告基因的表达是否发生改变，以确定该化合物的效果。Peterson 等54用血液循环不畅通的gridlock 突变体做材料，筛选出可使其恢复正常的两个小分子化合物；Stern 等55用crb 突变体进行筛选，发现小分子化合物Persynthamide 可阻止其发生肿瘤；Fleming 等56直接用野生型幼鱼筛选可促进骨发育的药物。这些研究工作均证明了利用斑马鱼进行药物筛选的有效性。3.3毒理学与环境检测在医药卫生、食品、生活用品等方面，每年都有新的化合物面世，它们是否对人体有害，需要进行安全性测试。斑马鱼胚胎和幼鱼对有害物质非常敏感，可用于测试化合物对生

19、物体的毒性57。与利用小鼠或大鼠进行的毒性实验相比，斑马鱼有多方面的优点：用药简单，只需将药物放入养殖胚胎的水中或快速注射；用药量很少；测试周期短，一般不超过1周；测试动物样本数可以很大，以确保统计学意义上的显著性；434生命科学第18卷可以评估药物对许多组织器官的影响程度。经济合作发展组织(OECD将斑马鱼列为了健康毒性和环境毒性检测的标准鱼类(/。美国的Phylonix 公司目前开展了药物毒性评估的商业性服务业务，评价指标包括胚胎成活率、药物的神经毒性、心血管毒性、肝毒性、肾毒性、胃肠毒性等。当前，环境污染，特别是水污染严重威胁着人类的健康，斑马鱼是检测

20、水污染程度的优良模式，国际标准组织(ISO已将斑马鱼推荐为河水毒性实验鱼种并制定了相应的标准(ISO07346，如Hallare 等58利用野生型斑马鱼，检测了菲律宾La-guna 湖的几个不同区域的水质污染程度。一种更直观、更灵敏、可以动态监测污染物的策略是利用转基因斑马鱼，它们可以响应污染物浓度的变化而表达出易于看见的荧光，如Carvan 等59制备了几种转基因斑马鱼，它们受环境中的多环烃、卤化共面分子、苯醌、或汞等重金属离子的激活而表达出绿色荧光蛋白或荧光素酶。由于有大量的斑马鱼突变体，又有较成熟的遗传操作手段，因此斑马鱼不仅可以用来检测化合物的毒性，还可以阐明其毒性的分子机理，如二恶英

21、是一类致畸、致癌、致突变的严重有害物质。研究表明，二恶英对斑马鱼胚胎发育的毒性是由细胞中的芳烃受体2(ARH2和芳烃受体核转运因子1(ARNT1所介导的，二恶英/ARH2/ARNT1复合体结合在靶基因(可响应二恶英的基因 的启动子上，激活了靶基因的表达60。4我国的斑马鱼研究我国在斑马鱼的研究方面已有十多年的历史。20世纪90年代初，北京市环境监测中心、北京市环境保护科学研究所、中国预防医学科学院等单位报道了斑马鱼在毒性检测中的利用6163。其后，王子仁等6465报道了斑马鱼视网膜的结构以及视神经损伤对视网膜结构的影响。目前，全国利用斑马鱼做模式动物的实验室近20个，在胚胎发育机理、疾病模型、

22、环境检测等方面开展了研究工作，特别是在胚胎发育的研究方面取得了一些世界公认的成果6668。5ZFIN 斑马鱼信息网络美国的一批科学家于1994年建立了在线斑马鱼信息网络ZFIN(http:/zfin/org,该网络收集了大量的斑马鱼相关信息，已成为斑马鱼领域的重要数据中心、学习园地、交流平台。在ZFIN 中，可了解到斑马鱼发育的基本知识，搜查野生型、突变体和转基因品系的相关信息，查询基因及其表达、染色体定位信息，查找实验室、研究人员和相关公司等等。参 考 文 献1Streisinger G, Walker C, Dower N, et al. Production of clonesof ho

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