用乳糖作为诱导剂进行重组蛋白的表达

1、维普http:/www.cqvip.CQm中国生翎制品学亲志20M年9月第18卷第点期 Odn J EiolopolB Stptcmber Xfit Vol. IS No.5* 409 *【实验技术】用乳糖作为诱导剂进行重组蛋白的表达郝淑美1王宣军张秀忙方勇关瞬甲盛军摘鑒)良的 研究用乳糖替代IPTG作为诱导刑进行重组蛋白的表达口方法 以表这SARS刺姿贺白片段的工程苗 BL21(DE3)/S为標型菌抹*采用葡萬糖、甘油作为碳澹不同浓度的乳糖和异乳榭柞为诱导剂，在摇瓶中进行表达实验。在40L 发酵谨中进行验证口结果 在摇瓶实验中冴L糖粮度大于Od mnwl/L即可成很好地诱导目的蛋白的表达，表

2、达盘与IPTG诱导 时相当；葡萄糖的存在可克押制乳糖但不能抑制异乳糖的诱导作用；梗用甘油作为碳源既不抑制乳皓+也不抑制异乳齬的 诱导柞用。在发酵雄实验中，诱导初始阶段葡糖糖的存在抑制乳糖的诱导作用口结论 在以乳糖操飙子为调控手段的工程 菌表达系统中可以使用乳糖柞为诱导剂，诱导阶段应采用韭葡荀糖碳源口芜键词乳糖操纵子;葡曹前;诱导Expression of Recombinant Gene in E * coli Using Lactose as InducerHAO Shu-mei T WANG Xuan-junT ZHANG Xiu-niaj et al (A Chunchun UniDen

3、iiyScience 农血/ Technology t Changchun 130022, China)Abfitrad Ofc(|ecthie To study the factor influencing the fermentabDn of recombinant E, oo/t elxabi using lactose as an inducer instead af IPTG - Methods lncuhal：e lhe gombinani: ELmii !BL21(DE3)/S sirain expressir the spike protein of SARS nms in 令

4、pinner* using gliiowe and glycerol as carbon source and th laioe： &itd isolacto&e at various corK-itfbot as inducers. Verify die fesuli by the fermeftta* bon in a 40 L fermentor*RsuJls In spnnerathe lactose al a canccntradon of mwe thsu 0-5 mmol/L jndwe募1 the CTprttMMi of twgtt protTj叭 and ihe expre

5、sion level was equivalent to that induced by IPTC. Glucose could inhibit the induction of laclose but could nal inhibit 吐比 induc- tiaiB of asolactose. However the giyceral as carbcm source showed no inhihrory effect cm the induction dT lactose or isdactosc. In fermentor, the 心6竝ace of glucae at earl

6、y stae inhibiledl the induction of lactose CofKlusaon Ln the expression system of recomEinant bacEerial strain uing hetose operoniT Lactose may be used 酩 an induceir B However, not|dlica&e caibon swircc shall be used at the stage of induetkm,Key words LBCtoec ; Glucoee; InductiGn维普http:/www.cqvip.CQ

7、m中国生翎制品学亲志20M年9月第18卷第点期 Odn J EiolopolB Stptcmber Xfit Vol. IS No.5* 409 *维普http:/www.cqvip.CQm中国生翎制品学亲志20M年9月第18卷第点期 Odn J EiolopolB Stptcmber Xfit Vol. IS No.5* 409 *ITTG是垂组蛋白表达常用的诱导剂但价格昂 贵，且有潜在的毒性而乳糖天然具有诱导乳糖 操纵子的作用。本文从细胞碳源利用和酶诱导的角 度岀发*对工程化大肠杆菌采用乳糖柞为碳源和诱 导剂时的碳代谢和目的蛋白的表达情况进行研究. 确定了工程化大肠杼繭采用乳糖作为诱导剂的

8、关键 点,并在较大规模的发酵实验中进行了验证。材料与方法1-菌株和试剂表达SARS刺突蛋白片段的工程菌BL21(DE3)/S 由长春生物制品研究所生物技术研究室提供。采用 美国NBS公司40h发酵罐进行工程菌的规模发酵。 LB培养基按照文献2配制口 1PTG购自SlCMAo2*乳糖浓度的确定挑収BL21(DE3)/ST程菌于5 ml LB培养基中作名单位：！辰春理工大学(氏卉330022)；2抚春隹物制品麻究 所傑春130062.通讯作杆:盛第,E-mail sjun雇：niai】 ccjl” b过夜培养16 h分别转接300皿过夜培养物于8个 装有lOmlLB培养基的100 ml三甬瓶中.继

9、续培养 5 h至冲网约为0.8分别加入乳糖至终浓度为0、 .02.04,0 和 8.0 mmol/L,第 8 瓶加人 【PTG至1 吹1几作为阳性対照，进行目的蛋白的诱 导。诱导3 h后.收菌.SDS-PAGE分析，井用薄层扫 描仪扫描目的蛋白条带占恿蛋白的百分比。3. 甘油和葡萄糖诱导效果的比较见文献3挑取BL21(DE3)/S工程菌于5 ml LB培养基中过夜培养16虬分别转接300 0过夜培 养物于6伞装有10 ml LB培养基的100 m!三角瓶 中，继续培养5 h至人血约为0.&分别加人不同的 诱导剂进行冃的蛋白的诱导。3 h后.收菌， PAGE分析目的蛋白表达量。

10、4. 乳糖作为诱导刑在发酵罐中表达目的霉白挑取BL21(DE3)/ST程菌于5 ml LB培养基中 过夜焙养12 h,全部转种至装有300 ml LB培养基的 1 L三角瓶中继续培养12 h后转种至2个各装有 I LLB培养基的3L三角瓶中培养3h后用于大罐维普http:/www.cqvip.CQm中国生翎制品学亲志20M年9月第18卷第点期 Odn J EiolopolB Stptcmber Xfit Vol. IS No.5* 409 *维普http:/www.cqvip.CQm 410 中国生物制品学杂击2005年勺月第讯轄第5期Chin J Ei气odfi Sqjlcmber 2DO5

11、VdUB Ndl5维普http:/www.cqvip.CQm维普http:/www.cqvip.CQm接种。发酵罐培养基碳源分别使用甘油和 葡萄糖。发酵参数为：弟,溶氧30%,pH化0士0J.利用堆加搅拌转速和增加通气是调节溶解氧 浓度当溶解氧浓度快速升高时流加碳源，碳源为 葡萄糖时、应保持葡萄糖浓度大于0 J%源为甘 油时.应保持甘油港度大于0塔养6h剧血达 到104以上后，加人乳糖至终浓度为0.5 mmol/L,进 行目的蛋白的诱导。同时流加乳糖，保持溶解氧不上 升中4诟收菌石DSPAGE分析目的蛋白表达氐结 果1-不同乳糖浓度对诱导目的蛋白表达的比较 在摇瓶实验中，乳糖浓度大于0.5 m

12、moVL即可 以很好地诱导目的蛋白的表达,且衷达虽与用PTG 为诱导剂时相当，见表Io2.葡萄糖和甘油对乳糖诱导作用的影响在用乳糖柞为诱导剂时f0J%葡萄糖即可使表 达量大大降低;但甘油对乳無的诱导作用没有抑制 效应，见图103+葡萄糖和甘油对异乳糖诱导作用的影响 在用异乳糖作为诱导剂时，肺萄雜和甘袖对乳 糖的诱导作用均没冇抑制效应见图2,4.在发酵罐中乳糖诱导目的蛋白的恚达用甘油作为碳源时，4 mmal/L乳糖的诱导效果 与用IPTG相似。用爾萄糊作为碳源时，探持荊萄糖 浓度在0.1輻，可抑制目的蚩白的表达。在蔺体生 长期使用葡萄糖作为碳源，诱导俞耗尽葡萄钠，再加 乳糖诱导,效果与IPTG类

13、似见图3oprutgin1：protein Mr Standard;2：0,5 mmol/L lactose oniy;3:05 mnxl/ lactose und 0.1% gJuco;4：0.5 mmol/lactose and 0x5% gjyceroi.图1不同碳源对乳辅诱导作用的影响Fle 1 * SDS-PAGE profile of SARS-S protein expressed in KL21 (PE3)induced by ladoee using fucose or glycerol as car- bua source表i SDfPAGE申SARS蛋白含的薄层拎描结果T

14、ab 1. This layer stxumiki of SARS-S proCein ml SD$-FAGEprofileInducerConcentration(rmiwl/L)SARSSprotein(驚)Lactfne0.1025.30.2547.50.5048.2LOO51 J2.0052,94.0Q51-48.0049 5ITTGLOO47.8proUiu1: pruljeiii Mr standard; 2： 0.5 mmol/L allolactose only; 3;0.5 mmol/L alloLiclcse and 0 gjucMe; 4： 0-5 mmol/L sllo

15、laclose aid 0.5% glycerol.图2不同橫泅对异乳糖诱导作用的影响F1& 2. SDS-PAGE profile of SARS-S prtriein expressed in BL2HDE3)induced by alloladosc usinfi fucose or glycerol as carbon sourceSARSS* prulrinltpniteiii Mr sbirtdanl;2t induced vtilh 0.5 nunot/l, Lactose and fud with Laciose,gjycerol uwd as carlwn source;3：

16、induced with 0+5 mmol/L lactase and fed with lactose.0*1% gju- cose mainlined; 4； induced with 0*5 mmol/L laclose and fud with Jacloae, hetose is added when glucose if used out ； 5 ； induced mlh 0.5 moHri/L Lactose and fed uilh luciosejO. 1% gjyc- erul main tailed.00 3 4GLfe酵碓中WARES表达菌的SDS-PAGEHkJ.

17、SDS-PAGE proGJe of BL21(DE3J/SARS-S produced in 40 L lemKDlor维普http:/www.cqvip.CQm中国生物制品学杂吉畑年尊月第18*5(55期 Chin J Bidc|S Somber 2DO5, Vol. 16 5 41】*卷奉文fit维普http:/www.cqvip.CQm中国生物制品学杂吉畑年尊月第18*5(55期 Chin J Bidc|S Somber 2DO5, Vol. 16 5 41】*维普http:/www.cqvip.CQm中国生物制品学杂吉畑年尊月第18*5(55期 Chin J Bidc|S Sombe

18、r 2DO5, Vol. 16 5 41】*乳糖操纵子披广泛用在大肠杆菌工程菌株的构 建中,异丙基申-D就基半乳糖昔（【PTC）柞为半乳栅 的类似物是常用的诱导剂& IFTG在大肠杆菌中不 披降解和代谢，诱导效果持久,诱导条件简单,加人 至终浓度O.Sl.OmmoUL即可。但IPTG有潘在的 毒性，各国药典均不提倡使用，井且价格昂贵中乳糖 作为原核细胞的常用碳源，是乳糖操纵子控制的细 菌自身系列酶的天燃底物，对乳糖操纵子具有天然 的诱导作用，且价洛低廉+无毒无害，缺点是由于乳 糖可以被细胞代谢作为能源，其浓度是动态变化的, 诱导条件不易拿握W 車文的研究表明，使用乳糖 操纵子的表达系统，在乳糖

19、浓度大于0mmol/L时 即可披有效诱导,且诱导效果与IPTG相当。1 knovin RS+ Rubinnon f Click BR. Revie*p: Optifttiail tmhjojr and culture conditions for ocpnssicxi of fwtd田i protein兽 under the vontroJ of dip lac prormCer. J Indi Micnjlnd H1996 B16; 145-154.2 萨始布楼亞J,弗里研 曼足昭蒂撕T,X子克降实笑指 南”金冬腓，黎孟枫，译,第2版，毗京：科学出版社-1WB.3 Mikko Anttt V, Peter M h d d-Qcec whey-induced hjgh-cell-clcn- ity production df Tincanibinaiil protjdns in Esehsritfun soli. Mionbia) Ceil Factories, 3003.2:2 12-_ Neuba