生物材料溶血性标准化评价方法比较_溶血率法和氰化高铁血红蛋白法

1、生物医学工程学杂志J B iom ed Eng2004; 21(1) : 111 114生物材料溶血性标准化评价方法比较：溶血率法和氰化高铁血红蛋白法张伶俐 朱蔚精 谭言飞 屈树新 张兴栋 (四川大学分析测试中心生物学评价实验室，生物材料工程研究中心，成都 610064)摘要采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法(根据ISO TR 7405)和氰化高铁血红蛋白法(根据ISO10993 24)测定了羟基磷灰石(陶瓷)和胶原(高分子材料)的溶血性能，结果提示这两种方法的结论是一致的，且氰化高铁血红蛋白法较血红蛋白直接测定法有灵敏、稳定、可比性好等优点，值得推广应用。但它存在着一些标准中尚未明确规

2、定的问题。作者在大量试验和不违背标准原则的基础上提岀了一些改进意见，使它更具有可操作性，以便于标准化评价生物材料的溶血性能。关键词生物学评价血液相容性溶血试验Com par is on betwee n Hemolysis Perce ntageM easureme nt and Hem iglob iincyan ideM easurement for Standard izing the Eva luation ofHem olytic Properties of B iomater ials.'|L J - II' ：'： "Zha ng Lngl iZ

3、huW eij ng Tan Yanfei Qu Shuxin Zhang X in gdo ng?(B iolog ica l Eva lua tion L aborota ry , A na ly sis and Testing Cen ter, Eng ineering R eseach Cen ter in B iom ateria ls,S ichuan U n iversity , Cheng d u 610064, Ch ina)Abstract In th is study , two m ethodsthe supernatant hemoglobin spectropho

4、tom etry , i e hemo lysispercentage m easurem ent (according to ISO TR 7405) and the hem iglobincyanide m easurem ent (according to ISO 10993 24)w ere used to assay the hemo lytic properties of hydroxyapatite (bioceram ics) and collagen (po lym er).The results show ed that the conclusi ons draw n fr

5、om using the two m ethods w ere basically consistent , and the lat2 ter w as mo re sensitive , stable and comparable . How ever, som e of the p rocedures in the hem iglobincyanide m ethod w ere no t defined in details . So based on our experi m ents w e have offered some suggesti ons and mp rovem en

6、ts, w h ich do no t deviate from ISO and A STM standards , for h iher p racticability of usig it in standardizing the evalua 2 tion of the hemo lytic p roperties of biom aterials . H em iglobincyanide m easurem ent is w o rthy of w ider app licati on.Key wordsB io logical evaluati on H emocompatibil

7、ityH emo lysis test& 1994-2010 China Academic Jcumal Electronic Publishing Huusc, AH rights reserved, h(p;/wenki生物医学工程学杂志J B iom ed Eng& 1994-2010 China Academic Jcumal Electronic Publishing Huusc, AH rights reserved, h(p;/wenki生物医学工程学杂志J B iom ed Eng1引言与血液直接或间接接触的生物材料必须评价它 的血液相容性。溶血试验检测生物材料

8、与红细胞的 相互作用，是一项非常重要的血液相容性评价试验,也是一项重要的体外粗筛试验。目前国内外大多采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法评价生 物材料的溶血性能16,但国际标准化组织(Inter2 nati onal standard organization, ISO)于 2000 年颁布 了 ISO D IS 1099324: 2000标准，重点推荐了氰化 咼铁血红蛋白法 (hemiglob incyanide, H iCN ),并指?联系人。E2n ail: zhangxd scu edu cn。T el: 028235412757明操作程序参考A STM F756293标准8。为了

9、与国 际接轨，我国正在准备出台相应的等同标准(GBT 16886 42xxxx )。然而,无论是 ISO D IS 109932 4: 2000还是A STM F756293都还有一些问题没有 规定和说明，给这一标准的实施带来一定的困难。比 如A STM F756标准要求用3只兔的血分别进行试 验,而ISO D IS 1099324: 2000要求最好用人血 ,也 可以用三只兔的混合稀释血代替人血，因为动物血中兔的溶血性能与人最接近。其次,A STM F756293和ISO D IS 1099324: 2000都没有规定无定形材料 的检测用量，等等。本文对HiCN测定法进行了一些 探索，重点分

10、析了不同血液来源和不同材料的测定 结果,比较了两种方法的优缺点，并且在不违背标准 原则的基础上提出了一些建议，以便更好地贯彻实& 1994-2010 China Academic Jcumal Electronic Publishing Huusc, AH rights reserved, h(p;/wenki112生物医学工程学杂志第 21卷施新颁布的标准(GB T 16886 4)。2材料和方法2 1材料和仪器选择了两大类生物材料。第一类是羟基磷灰石(H ydroxyap atite , HA )生物陶瓷,白色颗粒状,5 1 mm,其阴性对照选用氧化铝陶瓷，呈白色砂粒状。第二类是医

11、用高分子胶原(collagen),白色片状，厚度大于0. 5mm,其阴性对照选用医用输血袋聚氯 乙烯(Polych lorovinyl , PVC),无色透明片状,厚度 小于0 5 mm。新鲜兔血取自附有健康合格证的大 耳白兔，人血取自某单位健康体检人群 。可见与紫外 分光光度计(UV 755B型,上海精密科学仪器有限公 司分析仪器总厂制造，中国测试技术研究院检定)被 用于本试验。2 2氰化高铁血红蛋白法(HCN法)"102 2 1材料的准备颗粒或砂粒状材料取1 g放入一只试管中，蒸馏水洗3次,生理盐水洗3次,生 理盐水浸泡5 m in,沥干备用。厚度大于0. 5 mm的 片状材料取

12、15 cm2 (单面面积) ,厚度小于 0 5 mm 的取30 cm2(单面面积)放入一只试管中。每种材料 准备6个试管。2 2 2血液的准备抗凝剂用肝素或A CD液(枸橼酸4 7 g L ,枸橼酸钠13 3 g L ,葡萄糖30 0 g L )。兔血或人血的血浆游离血红蛋白浓度应小于 1. 0m g mL。用生理盐水稀释全血至总血红蛋白浓 度小于1. 250± 0 125 mg mL。另外稀释三只兔的 等量混合血，混合血的血浆游离血红蛋白和全血的 总血红蛋白浓度均应满足上述要求。取稀释血1mL ,加入3 mL D rabk in '试剂(碳酸氢钠1. 0 g L , 氰化钾

13、0. 05 g L ,铁氰化钾 Q 2 g L )中，测吸光度 (OD 540)值，即得1 mL稀释血中的总血红蛋白。2 2 3材料与血液接触于每种材料6只试管中各加入5mL稀释全血，轻轻混匀。6只试管分成两 组进行静态试验和动态试验。静态试验组在37 ± 2 C恒温水浴中静置 4h,动态试验组在37± 2C的条 件下，置振摇板上振摇混合1 h,垂直方向不超过45 °振摇频率为30 ± 6 r m in。2 2 4吸光度的测定取出上述试管，以70旷800 g离心5 m in,小心吸取上清液1 mL ,加入3 mL Drabkin 's试剂中，在紫

14、外2可见分光光度计 (UV 2 755B)上,用D rabk in '试剂调零，测定540 nm波长 下的吸光度(OD 540)值,光径1 cm。查标准曲线，即 得游离血红蛋白浓度。2 2 5 计算溶血指数(H emo lytic index, H. I )H . = 1mL 上清液中的游离血红蛋白H. . =1 mL稀释血中的总血红蛋白2 2 6结果判断 溶血指数为 0- 2,不溶血；溶血 指数为 2 10,轻度溶血；溶血指数为10- 20,中度 溶血；溶血指数为 20- 40,明显溶血；溶血指数 40,重度溶血。2 3游离血红蛋白直接测定法11142 3 1材料的准备 颗粒或砂粒状

15、材料取5 g放入一支试管中，洗涤方法同前。片状材料厚度大于0 5 mm取30 cm 2(单面面积)放入一支试管中。阴 性对照为生理盐水 (0 9% N aCl solution, N S),阳 性对照为蒸馏水，各取10mL装入一支试管中。材 料、阴性对照、阳性对照各准备3只试管。232血液的准备取一只健康家兔的鲜血2m l,肝素抗凝，加入2 5ml生理盐水稀释，0. 2mL 稀释血在10mL蒸馏水中于波长 545 nm处的吸光 度值应为0 8 土 0 $2 3 3材料与血液相接触在 3只装有样品的试 管中每只加入10 mL生理盐水，与阴性对照组和阳 性对照组同时放入37 ± 2C恒温

16、水浴中静置30min,加入Q 2mL稀释血，再在37 ± 2C恒温水浴中 静置1 ho2 3 4吸光度的测定取出上述试管 ，以700800 g离心5 m in。小心吸取上清液4 mL ,在紫外2可 见分光光度计(UV 2755B)上,用生理盐水调零，测 定545 nm波长下的吸光度(OD 545 )值，光径1 cm。 阴性对照组的吸光度的平均值为Dnc，阳性对照组的吸光度的平均值为 Dpc,样品的吸光度为Dto计算溶 血率乙D pc - D ncx 100%2 3 5结果判断试验样品的溶血率应小于5%,若大于5%则预示材料有溶血作用。3结果3 1 H CN法检测羟基磷灰石陶瓷颗粒的溶

17、血指 数首先测定了样品在不同兔血中的溶血指数(结果见表1)。证实不同个体的兔血对试验结果有影 响。199201 (J China Acadwnic Joumal Electronic Publishing Huusc, All rights reserved,第1期张伶俐等生物材料溶血性标准化评价方法比较：溶血率法和氰化高铁血红蛋白法113表1 HA颗粒与不同个体的兔血接触的H CN法试验结果Table 1 The results of HA in contact with differen t rabbit blood by H CN method1 aterialsR abbitsH em

18、o lytic i of static tndex estF or qPHA8#36 5± 7. 214 4< 0 0113#18 7± 0 715#42 3 ± 41R abbits22 7 ± 19与23 09< 0 01HumanA5 5± 00与18. 95< 0 01HumanB3 2± 07与4. 14< 0 05A I2O38#2 2± 065. 27< 0 0513#1 5± 0015#4 9± 08N S8#2 2± 170. 25> 0 0

19、513#1 1± 0015#2 4± 16MH emolytic indexof static test68.5± 4554. 2<00124.3± 3465.8± 2455.0 ± 131 3与1001<00111.3± 20与8.48<0016. 4 ± 1.4与1.53>0055.6 士 1.10.35>0054. 5 ± 268.1 ± 1.65.0 ± 1.77.22<0054.1 ± Q73.2 ± 1.6©

20、 1994-2010 China Academic Joumal Electronic Publishing Huusc, AH rights reserved, htlp;/wwta；.enki第1期张伶俐等生物材料溶血性标准化评价方法比较：溶血率法和氰化高铁血红蛋白法#注:、是按三个组的溶血指数的均数从大到小排列,3HA : hydroxyapatite ; H iCN : hemiglobincyanide© 1994-2010 China Academic Joumal Electronic Publishing Huusc, AH rights reserved, htlp

21、;/wwta；.enki第1期张伶俐等生物材料溶血性标准化评价方法比较：溶血率法和氰化高铁血红蛋白法114ISO D IS 1099324: 2000指出，最好选用人血做溶血实验，也可以用三只兔的混合稀释血液代替人 血。因此本试验又测定了样品在8#、13#、15#兔的混合兔血(Rabbits)和人血A、B中的溶血指数(见 表1)。结果说明即使将兔血混合在一起，仍与人血 的试验结果有统计学上的差异，而且不同人的血液所得的试验结果之间亦具有统计学上的差异。根据A STM F756293,对混合兔血的试验结果 进行评价，该批次的HA颗粒在动态条件下有明显 溶血,在静态条件下有重度溶血。3. 2游离血

22、红蛋白直接测定法测定羟基磷灰石陶瓷颗粒的溶血率结果见表2。表2 HA颗粒用游离血红蛋白直接测定法的试验结果Table 2 The results of HA by supernatan t Hb spectrophotometryM aterialsA bsorbance(OD545)H emo lysis percentageHA0 672 ± 0. 00886 3% ± 1 00%N S0 018 ± 0. 002H2O0 775 ± 0. 019根据 GB T 14233 2293 和 YY T 0127 1293 标 准,本试验材料的溶血率为 8

23、6 3% ± 1. 00% ,大于 5% ,提示材料有溶血作用。这与H iCN法所得试验 结果相吻合。3. 3两种方法检测胶原的溶血性能(1) 材料与混合兔血接触后,氰化高铁血红蛋白 法测定胶原的溶血指数的试验结果见表3。表3胶原的动态和静态试验结果Table 3 The dynam icand static results of collagen by H CN methodM aterialsH emolytic indexH hemo lytic indexof D ynam ic testof Static testCollagen9 5± 0. 920. 8

24、77; 2 3PVC1 4± 0. 90 9± 0 0率，结果见表4。表4胶原用游离血红蛋白直接测定法的试验结果Table 4 The results of collagen by supernatan t Hb spectrophotometryM aterialsA bso rbance (OD 545)H emolysis percentageCollagen0 264 ± 0 02430. 4% ± 3. 17%N S0 028 ± 0 002H 2O0 805 ± 0 027由此可以看出，两种溶血试验方法的结果是吻 合的,都

25、提示这批胶原材料有溶血作用。H iCN法的评价更进一步说明，这批胶原材料在动态条件下为 轻度溶血，在静态条件下为中度溶血。4讨论目前标准化评价生物材料的溶血性能的试验方 法主要有游离血红蛋白直接测定法和氰化高铁血红 蛋白测定法。1978年美国AN SI ADA规定了游离 血红蛋白直接测定法作为评价牙科材料溶血性能的 方法，1984年，ISO TR 7405284(E)正式推荐了此 方法。我国对生物医学材料的评价起步较晚，缺乏溶 血试验的评价标准。在80 90年代,我国陆续颁布 了 W S52121987医用热硫化甲基乙烯基硅橡胶标 准YY T 0127. 1293口腔材料生物试验方法、GB T

26、 14233 2293医用输液、输血、注射器具检验 方法等标准,它们都采用了ISO TR 7405284 ( E)的试验方法。在此基础上，目前很多生物材料溶血性 能的检测也都使用游离血红蛋白直接测定法。然而H iCN法的优点亦不容忽视。1966年国际血液标准 化委员会推荐氰化高铁血红蛋白作为国际标准方 法。1978年国际临床化学联合会和世界病理学会联 合发表的国际性文件中重申了 HiCN法。1982年美 国材料与试验协会(A STM )在医用材料和装置选© 1994-2010 China Academic Joumal Electronic Publishing Huusc, AH

27、rights reserved, htlp;/wwta；.enki第1期张伶俐等生物材料溶血性标准化评价方法比较：溶血率法和氰化高铁血红蛋白法#(2) 游离血红蛋白直接测定法测定胶原的溶血择的一般生物学试验方法的实施标准中推荐了© 1994-2010 China Academic Joumal Electronic Publishing Huusc, AH rights reserved, htlp;/wwta；.enki第1期张伶俐等生物材料溶血性标准化评价方法比较：溶血率法和氰化高铁血红蛋白法#© 1994-2010 China Academic Joumal Elec

28、tronic Publishing Huusc, AH rights reserved, htlp;/wwta；.enki116生物医学工程学杂志第 21卷H iCN 法，此后 ISO 1099324: 1992 将 H iCN 法作为 医疗器械的溶血试验评价方法，ISO D IS 1099324:2000标准重点推荐了 H iCN法。作者通过试验，发 现HiCN法在实际操作中尚有一些标准中没有阐明 的问题，由此,提出了一些建议。（1）在稀释血液的准备过程中，ASTM F756293 标准要求用3只兔的血分别进行试验，这样操作起 来太复杂，由此带来的误差较大；而ISO D IS 1099324

29、: 2000要求最好采用人血，如人血不容易得 到,使用与人的溶血性能相近的动物血也是可行的。据报道15,兔和人的红细胞有相同的溶血性能。因此ISO D IS 1099324: 2000规定也可以用 3只兔的混合稀释血代替人血，并且最好这3只兔是同一血 型。这在实际操作时仍较困难：其一，目前我国提供 实验动物的单位还不能提供所售家兔的血型；其二,根据文献16,家兔的血型系统（红细胞型）主要有 H 1'H2系，G、g系，K1、K2系和He系四种，市售用于 测定家兔血型的试剂少见，且测定每只家兔的血型 还会增加实验方法的复杂程度和成本。作者将任意 选择的三只健康兔的血等量稀释混合后未见明显的

30、 溶血和凝血现象，且经实验证明这种稀释混合血能 够保证结果的准确性，也减少了不同兔的个体间的 差异，是比较可行的。但这种稀释混合血与稀释人血 相比仍有明显差异（p 0 01）,即稀释混合兔血并不能完全等同于人血，同时考虑到标准化的试验方 法应该是步骤少而误差少，笔者认为采用一只兔的 血液是更加可行的。由此虽然不同的实验室可能得 到不完全相同的溶血指数，但变异应该在同一等级 （按溶血指数分为不溶血 、轻度、中度、明显、重度溶 血这五级）内,仍具有可比性。（2）在材料的准备工作中 ，ASTM F756293和 ISO D IS 1099324: 2000都没有规定无定形材料 （如 颗粒和粉末）的检

31、测用量，本试验采用了 GB T 16886 1222000推荐的无定形材料的浸提比例 （0 1 0 2g mL ,即1g 5mL稀释血）来计算检测用量， 通过试验认为是适宜的可行的 。（3）在结果的评价方面,A STM F756293规定,溶血指数（2为不溶血；2 10为轻度溶血；10 20为中度溶血；2（40为明显溶血； 40为重度溶 血。参照A STM F 981286的评价方法，即5级评价 分类中前两级均认为是可以接受的，因此认为若溶血指数 10就可以认为材料通过了评价 。应该注意 的是,不可能对所有医疗器械及其应用规定一个统 一的合格与不合格的溶血量值。合格判定应根据风 险与受益评价的

32、一些形式来确定。当器械引起溶血 时,必须确认该器械的临床受益，并且溶血是在临床 可接受的限度内。比如本试验中检测的可作为凝血 材料的胶原。H iCN法较溶血率法有着不可忽视的优点：（1）从试验原理上来看，H iCN法较溶血率法更加灵敏 和稳定，重复性也好。因为氰离子与血液红细胞中的 铁离子结合非常迅速而完全，结合后形成的氰化高 铁血红蛋白很稳定，在4 C下可以保存6个月之久, 方便检测工作的留样和质量管理。而且采用HiCN法最大的优点就是可以自动化，并且使各个实验室之间的试验结果具有可比性。采用同种的阴性对照材料而不是生理盐水，更加符合GB T 16886 122 2000的统一要求。（3）在

33、材料与血液接触之前，测定 血液的游离血红蛋白，筛除了自身有溶血的血样（可 能是由于采血过程中红细胞损伤引起的）。而溶血率 测定法则必须在试验结束后，视生理盐水组的溶血 率是否大于0. 03来判断结果的可靠性。（4）HiCN 法既考虑到了静态条件下材料的溶血性能，又考虑到了动态条件下材料的溶血性能。（5）结果评价按溶血指数的大小进行了分级评价。当然,H iCN法也有一些缺点。最大的缺点就是 所用的试剂含有氰化钾，它在各种接触方式下都具 有毒性。但是,只要在配液和操作过程中小心，采用次氯酸钠氧化法处理废液和用过的容器，就不会有危险。次氯酸钠遇氰离子时发生反应：5CO2+ 2CN 22 22 2+

34、2OH = 2CO3 + N2+ 5Cl + MO。此外，H iCN法还较溶血率测定法操作更加复杂一些。但为了取得灵敏和稳定的结果，使各不同实验室之间的试验结果具有可比性，HiCN法值得推广应用。在入世以后将有大量的医疗器械和生物材 料涌入我国，我国的生物材料也将亮相于国际市场。此时保持检测方法的标准化是极为重要的。参考文献1 L iu YH , Wen SL, Xiao ZW. Study of manufacture and bioeom2 patibility of comp lex bioactive hydroxyapatite ceramic Chinese Journal of

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