壳聚糖_明胶网络_羟基磷灰石复合材料支架的研究_成骨细胞培养

1、组织工程壳聚糖2明胶网络 羟基磷灰石复合材料支架的研究成骨细胞培养赵峰1尹玉姬1姚康德1郭刚2王宝利2张镜宇2章明放3【摘要】目的研究大鼠颅骨成骨细胞在壳聚糖2明胶网络 羟基磷灰石(CS2Gel HA复合材料支架上的生长情况。方法将原代培养大鼠颅骨成骨细胞第3代,密度为1.01×106 m l悬液,种植于孔隙率分别为85.20%、90.40%和95.80%的CS2Gel HA支架材料中,利用细胞计数法检测种植后3天,1、2及3周的细胞增殖曲线,采用H E和von Ko ssa染色方法观察细胞生长、骨样组织形成和矿化沉积情况。结果大鼠颅骨成骨细胞在孔隙率为85.20%的支架中增殖较慢,

2、在孔隙率为90.40%和95.80%的CS2Gel HA复合材料支架上生长良好,增殖较快,周围分泌有大量细胞外基质,3周时局部已出现骨样组织,且细胞 支架结构物有利于钙质沉积。结论CS2Gel HA复合材料支架有望成为培养自体成骨细胞的材料,以重建新的骨组织。【关键词】组织工程壳聚糖2明胶网络 羟基磷灰石成骨细胞细胞外基质TI SSUE ENGI NEER I NG STUDY ON CH I T OSAN-GELATI N HYD R OX YAPATI TE COM POSI TE SCAFF OLD S OSTEOB LASTS CUL TURE ZH A O F eng,Y IN Y

3、u2j i,YA O K ang2d e,et al.R esearch Institu te of P olym eric M aterials,T ianj in U niversity.T ianj in,P.R.Ch ina300072【Abstract】ObjectiveTo investigate the behavi o r of rat calvarial o steoblasts cultured on ch ito san2 gelatin hydroxyapatite(CS2Gel HAcompo site scaffo lds.M ethodsT he rat calv

4、arial o steoblasts(the3rd passagew ere seeded at a density of1.01×106cells m l onto the CS2Gel HA compo site scaffo lds having po ro sity 85120%,90140%and95180%.Cell num ber w as counted after cultured fo r3days,1w eek,2w eek s and3w eek s.Cell p ro liferati on,bone2like tissue fo r m ati on,an

5、d m ineralizati on w ere separately detected by H E,von Ko ssah isto logical staining techniques.ResultsT he CS2Gel HA compo site scaffo lds suppo rted the attachm ent of seededrat calvarial o steoblasts.Cells p ro liferated faster in scaffo ld w ith h igher po ro sity90140%and95.80%than scaffo ld w

6、 ith low er po ro sity85120%.T he o steoblasts scaffo ld constructs w ere feasible fo r m ineral depo siti on,and bone2like tissue fo r m ati on in3w eek s.ConclusionT h is study suggests the feasibility of using CS2Gel HA compo site scaffo lds fo r bone tissue engineering.【Key words】T issue enginee

7、ringCh ito san2gelatin hydroxyapatiteO steoblastsExtracellular m atrixFoundation ite m s:N ati onalBasic Science R esearch and D evelopm ent Grants(G1999054305;N ati onalN atural Science Foundati on of Ch ina(59883002骨具有再生和自行修复能力,因肿瘤切除、外伤、骨疾病及骨异常生长所造成的骨缺损,在单纯依靠骨自行修复无法愈合的情况下,则需采用手术治疗。传统的移植方式主要有自体骨移植和

8、异体骨移植,但自体移植骨源有限,而异体骨移植又有传播疾基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(973:组织工程的基本科学问题(G1999054305;国家自然科学基金资助项目(59883002作者单位:1天津大学高分子材料研究所(天津,300072;2天津医科大学内分泌研究所,3病理科病和免疫排斥反应等问题。近年来开发的组织工程学研究方法13。其基本方法是将体外培养的高浓度种子细胞种植于具有生物相容性和可降解性的天然或人工合成的细胞外基质(ex tracelluar m atrixes,EC M上,然后将此细胞 支架结构物移植到体内,以诱发所希望的细胞响应(粘连、分化和增殖。在体内细胞继续增殖

9、,而支架则随着新组织的形成在体内逐渐降解,其产物被机体吸收,从而达到修复组织的目的。1材料与方法1.1材料DM E M培养基(Gibco,含10%胎牛血清(FB S,Gibco;0.25%胰蛋白酶(Sigm a;0.02% ED TA(A ldrich;培养用三蒸水。1.2方法1.2.1细胞培养支架材料的准备将相分离法制备4的孔隙率分别为85.20%、90.40%和95.80%的壳聚糖2明胶网络 羟基磷灰石(ch ito san2gelatih hydroxyap atite,CS2Gel HA复合支架材料裁剪成直径7mm,厚度1.5mm的圆盘状,置于48孔培养板的孔底,75%的乙醇溶液浸泡1

10、小时,用三蒸水反复冲洗,除去水分,在密闭环境中用高效紫外灯照射1小时。灭菌后的材料用培养液浸泡30分钟,除去多余液体。1.2.2支架材料中成骨细胞的种植将原代培养大鼠颅骨成骨细胞(第3代稀释至密度为1.01×106 m l,用加样器吸取0.1m l细胞悬液,均匀加入到支架材料中,于培养箱中恒温培养3小时,再向培养孔中加入充足的培养液。每23天更换培养液。1.2.3支架材料中成骨细胞的计数将培养到3天,1、2及3周的标本从培养液中取出,用PB S液冲洗两次,加入0.7m l消化液(含0125%胰蛋白酶, 0102%ED TA消化35分钟,用吸管轻轻吹打数次,再加入0.1m l FB S

11、以终止消化,充分挤出支架中液体后,用细胞计数板记数。1.2.4组织学切片及染色将培养到1、2及3周的标本从培养液中取出,PB S液冲洗两次,用10%中性福尔马林溶液在4固定24小时,以梯度浓度的乙醇溶液逐级脱水。石蜡包埋并按表面或断面切片(46m,H E、von Ko ssa染色。2结果2.1成骨细胞在复合材料支架中的增殖成骨细胞种植于相分离法制备的孔隙率分别为85.20%,90.40%和95.80%的CS2Gel HA复合材料支架中培养后,第3天,成骨细胞在孔隙率为90140%的复合材料中存留最多,孔隙率为85.20%的材料中存留最少。孔隙率为95.80%和90.40%的支架中呈良好生长态势

12、,3周内可见数量增多,而孔隙率为85.20%的支架材料中生长状态略差(图1。2.2组织学观察1周时成骨细胞在孔隙率为90.40%的复合材料支架上黏附性良好,形状呈圆形或柱状,核为圆形或椭圆形;支架上沉积有染色后呈浅粉红色的EC M (图2。3周时材料周边细胞密度增大,包埋在其周围分泌大量EC M中,几乎将材料孔洞填满,并与材料混合在一起(图3,活体结构物中局部还可见少数细胞嵌于含有大量EC M的骨样组织中(图4 。图1成骨细胞在三种孔隙率的复合材料支架中的增殖曲线F ig.1The proliferation curves of osteoblasts i n three porositysc

13、affolds2.3复合材料支架的矿化成骨细胞增殖的同时,不同孔隙率的材料、细胞分泌物和骨样组织中均有钙质沉积,3周时已较为密集(图5。3讨论细胞所分泌的EC M将细胞隔离且提供信息,同时作为调节剂(细胞因子和生长因子的释放载体,在调节与其相联系的细胞行为方面起着十分积极和复杂的作用。骨组织工程研究重点是寻求能够作为细胞移植与引导新骨生长的人工EC M,它具有良好的生物相容性、可降解性;良好的骨诱导性、骨传导性;负荷最大量细胞的高渗透性;支持骨细胞生长和功能分化的表面化学与拓扑结构;可作为调节剂如骨形成蛋白、转移生长因子2和血小板衍生生长因子的释放载体以促进骨形成;可消毒性5。有关成骨细胞在人

14、工EC M三维支架中的培养已有报道,如胶原蛋白基质、聚乙醇酸网络、聚乳酸和HA生物陶瓷等69。而胶原蛋白力学强度差,其同种或异种来源物有可能引起免疫排斥反应,且细胞系胶原纯化转染也可能带来感染。聚乙醇酸不仅力学强度低,厚度薄(100m,使其在治疗较大或大块骨缺损方面有一定难度。聚乳酸降解会使局部酸性增强而引起炎性反应。纯HA陶瓷支架降解速图21周时,成骨细胞在复合材料支架中黏附性良好,并沉积有浅粉红色的细胞外基质(HE×400图33周时,成骨细胞在复合材料周边密度增大,包埋在大量细胞外基质中(HE×400图43周时,成骨细胞在复合材料支架中形成骨样组织,局部有少数细胞嵌于大

15、量细胞外基质中(HE×400图53周时,成骨细胞在复合支架材料中有骨化倾向,并有钙质在复合支架上沉积(von Kossa染色×400F ig.2O steoblasts attached well on the chitosan-gelati n hydroxyapatite co mposite scaffold,and pi nkish EC M s for med at1week(HE×400F ig.3O steoblasts proliferated i n the osteoblasts scaffold con struct and were e m

16、bedded i n the secreted EC M s at3weeks(HE×400 F ig.4Bone-like tissue for med i n the steoblasts scaffold con structs at3weeks,which is disti nguished by few cells e mbedded i n greater abundance of EC M s(HE×400F ig.5O steoblasts scaffold con struct had osteosis trend at3weeks,and calc iu

17、 m deposited i n the co mposite,EC M s and bone-like tissue(von Kossa×400度慢,不宜被新的自体骨长入而替代,并有可能改变新生骨的力学强度。天然EC M为物理和化学交联的蛋白质和糖胺聚糖(glyco sam inoglacan s,GA Gs网络,其主要成分为粘连蛋白和纤维蛋白与GA Gs,对硬组织而言,同时含有纳米级HA。CS结构类似于GA Gs,是一种生物可降解的聚阳离子多糖,它能与细胞膜负电成分呈现非特异相互作用10,并可调控生物活性分子释放11,促进骨形成。与胶原蛋白结构相似,其中含有天冬氨酸2甘氨酸2谷氨

18、酸2丙氨酸细胞结合结构域,利于细胞粘连。HA具有良好的生物相容性和骨传导性,是骨组织的成分。据此,我们构建了成分类似于自然骨的CS2Gel HA复合材料支架,实验表明,成骨细胞在适当孔隙率的支架中黏附性和生长状态均良好,呈组织化趋向,且不同孔隙率的材料和细胞合成EC M均非常有利于钙质沉积,CS2 Gel HA复合材料支架有望成为新的工程化骨组织替代材料。 4参考文献1L anger R,V acanti JP.T issue engineering.Science,1993;260 (5110:9202C rane G M,Ishaug SL,M iko s A G.Bone tissue

19、engineering.N at M ed,1995;1(12:13223Putnam A J,M ooney DJ.T issue engineering using synthetic extracellular m atrices.N at M ed,1996;2(7:8244赵峰,尹玉姬,宋雪峰,等,壳聚糖2明胶网络 羟基磷灰石复合材料支架的研究制备及形貌.中国修复重建外科杂志, 2001;15(5:2655F reed L E,V unjak2N ovakovic G,B iron RJ,et a l.B i odegradable po lym er scaffo lds fo r

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23、 the m atrix depo sited by o steoblast2like cells.B i o techno l P rog,1999;15(1:1911Park YJ,L ee Y M,Park SN,et a l.P latelet derived grow th facto r releasing ch ito san sponge fo r peri odontal bone regenerati on.B i om aterials,2000;21(2:153(收稿:2000212218修回:2001210212邻指指背筋膜蒂皮瓣一期修复手指掌侧电击伤李罗珠于益鹏孙步梅我科1996年1月2000年6月,采用邻指指背筋膜蒂皮瓣一期修复手指掌侧电击伤所致的皮肤软组织缺损15例,术后皮瓣全部成活。随访612个月,效果满意,报告如下。1临床资料本组15例,男9例,女6例。年龄737岁。均为手指掌侧电击伤致皮肤软组织缺损。缺损