肺炎链球菌转化模型的建立

1、肺炎链球菌转化模型的建立 08-10-13 10:02:00 编辑：studa20 作者：赵清，李南，张雪梅，胥文春，朱兴华，张群，尹一兵【摘要】 目的： 建立一种更加稳定、高效的肺炎链球菌实验室转化模型，以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造. 方法： 分别用改进方法和既往方法制备肺炎链球菌感受态细胞，转化外源DNA，获取发生了转化的菌株，通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化；并计数抗生素筛选平板上的转化菌落，比较两者的转化率，以确定更佳的转化模型. 结果： 肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改进方法的转化率分别为（0.890.20），（0.710.10），高于既往方法的转化率分

2、别为(6.21.4)10-3，(5.71.1)10-3 ，构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株，建立了改进的肺炎链球菌实验室转化模型. 结论： 改进的转化模型实现了稳定的肺炎链球菌实验室转化，能方便研究者对该菌进行各种遗传操作，为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台. 【关键词】 肺炎链球菌；转化，细菌；感受态【Abstract】 AIM: To establish a transformation model of Streptococcus pneumoniae(S.pn) in laboratory to promote the transformation efficiency and

3、 reconstruct its chromosome gene by improving the previous transformation method. METHODS: The competence cells of S.pn were prepared using both the previous and improved methods. After the exotic DNA was transformed under certain cell density, the transformed colonies on antibiotic plate, which was

4、 identified by growing in antibiotics culture and PCR, were counted to compare their transformation rate. RESULTS: The improved transformation model of S.pn in laboratory was established. The transformation rate of S.pn 334 was （0.890.20） and S.pn 31203 was （0.710.10） under the improved transformati

5、on model, which was relatively higher. Using this model, we constructed 4 S.pn competencedefective strains. CONCLUSION: In laboratory, the improved transformation model can raise the transformation rate of S.pn, which induces different S.pn into competence, and provides a research technology for fur

6、ther investigation on pneumococcal pathogenesis.【Keywords】 occus pneumoniae; transformation, bacterial; competence0 引言 转化是指细菌在自然生长状态下可自发形成感受态（特指细菌能够摄取外来游离DNA的一种状态），摄取外源性DNA，通过同源重组导致基因发生改变的过程. 通过转化可以改造细菌基因，进行功能基因组研究，它是研究肺炎链球菌（S.pn）生物学功能的重要手段. 本课题组既往的S.pn实验室转化模型1有两大弊端：一是转化效率不稳定；二是感受态开放时间较短，不能满足大规模转化的需

7、要. 有研究2认为冷刺激可能会延长感受态开放时间，我们据此对既往转化模型进行改良，即冷冻处理细胞后再做转化，以期克服其弊端.1 材料和方法1.1 材料 S.pn血清4型标准菌株TIGR4(ATCCBAA334)，干粉（美国ATCC微生物菌种保存中心）；S.pn血清3型标准菌株CMCC(B)31203，干粉（中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保存中心）；S型S.pn(1和2号菌株)由中国医科院提供；主要遗传特征经鉴定合格. C+Y培养基：含5 g/L Yeast提取物（Lacks and Hotchkiss, 1960）；TSA 血平板：含50 mL/L兔脱纤维全血. 感受态刺激因子（CSP2

8、）由挪威生命科学大学Havarstein LS教授惠赠；S.pn CP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）由美国Morrison教授惠赠；S.pn 1d菌株的基因组DNA(含红霉素抗性基因erm 的comE断裂基因)由本课题组构建3；DNA提取试剂盒（上海华舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；胰蛋白胨、大豆蛋白胨（Gibco公司）. 722分光光度仪（上海仪器分析三厂）；-80低温冰箱（日本SANYO Medical freezer MDF330型）.1.2 方法1.2.1 S.pn的生长曲线绘制 挑取S.pn单个菌落接种于C+Y培养基，37培养12 h，转接于20

9、 mL C+Y培养基中，于37水浴孵育，从1 h后开始在分光光度仪上测菌液A620 nm值，之后每隔1 h取样1次. 以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制细菌的生长曲线.1.2.2 改进的S.pn实验室转化模型的建立1.2.2.1 改进的S.pn实验室转化模型 取冻存于-80冰箱的S.pn菌株，培养于CTM培养基（含C+Y培养基，1 mmol/L CaCl2，0.1 g/L BSA）中，37水浴至A550 nm0.1左右时，将甘油加入上述菌液中，至其终浓度为100 mL/L，分装后冻于-80，此即为S.pn感受态细胞；24 h后取出冻存菌液，在冰上融化，9000 g离心1 min，弃去上清液，加

10、入100 L C+Y培养基（pH8.0），使沉淀彻底悬浮，加入CSP20 g/L，同时加入S.pn CP1250的染色体DNA 100 g/L，于37孵育90 min，铺于含200 mg/L链霉素的TSA血平板上，于37孵箱培养2448 h，即得到转化菌落. 1.2.2.2 方法学比较 取冻存于-80冰箱的S.pn菌株，分别用上述改进方法和既往方法1制备S.pn感受态细胞，然后加入CSP2 20 g/L，并加入S.pn CP1250的染色体DNA100 g/L，于37孵育90 min，铺于含200 mg/L链霉素的TSA血平板上，于37孵箱培养2448 h，计数抗生素血平板上的转化菌落. 转化

11、率=平板菌落数/细菌总数100%. 其中，细菌总数按A620 nm=0.6时， 细菌数为5 1011 cfuL计算.1.2.3 S.pn感受态缺陷菌株的制备及鉴定1.2.3.1 感受态缺陷菌株的制备 用上述改进的转化方法制备S.pn感受态细胞，然后加入CSP2 20 g/L，及含comE断裂基因的染色体DNA（即S.pn 1d菌株DNA）100 g/L，于37孵育90 min，铺于含0.25 mg/L红霉素的TSA血平板上，于37孵箱培养2448 h，挑取平板上的转化菌落，接种于含0.25 mg/L红霉素的C+Y培养基中，37培养增菌，当菌密度为A620 nm=0.2左右时，冻于80冰箱保存，即得到缺陷菌.1.2.3.2 感受态缺陷菌株的鉴定 鉴定1：将野生菌和缺陷菌同时做转化，选用CP1250的DNA为外源基因. 鉴定2：提取野生菌和缺陷菌的染色体DNA，用comE（5TGCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG3，5ACCAACGGACCTTCTATCTGTAGC3）和erm（5CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT3， 5AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT3）的引物4做PCR.