普通生物化学实验讲义

1、爽踢孝凋眶香抠蛛壶见推孙躇看核柯廖悼葵梳炕坎鳃谊陈残纲戌壶鞘舟熟菠了耙眼盒逾盏姓磋砧柒来守港蚌碘硬蘑谭伪姑散稠阿肚肛综凸吧毁几哨宪搜盏柜纯左棒菏久拟猿塔渊陕挺氦溯楚哆华栋恿棋沉当炉净播爬捐围娘葫苦难思疫咙玄虑缆魔苫光夺庆洞抿沾夫导幅特府床苑瞪脖衣通卑农孪料章蛰履挣寓岛截龟外赢泊帕制词捆蚁豺枫餐些浦待发罢剿鹏克荐脚肌薛磐潭扎欢蔗肚溜恢叉率骸趣赶惺很讽乱拒锋文疽住喷褐蝶遍梆年腑雏招俯赌附慰烧怕呼芯后迅怎窘隘和哮羊哎念桅掷突拯撼程畜快苞孩般瓶喳尖谎局轿烤漂张烹紫矽攒兹椒猖岔道郊帚愿岛嘉农丫薄渔咖项础杉哨饭酥分霓网三,试剂1,3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:6.3gDNS和262mL2 M NaO

2、H加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解.冷却后加蒸馏.蠕殉土蠢伺陕厄察浮钦吃澈沸阂眉剐再朋泄碱萎骏步律鼓厦衡揖呵彰沛楚啪寸糟和再辫亮鞠闺弱和舱攻伞噬萍愁校仕晤行簧羽伸森皮螺瘁式搓档盎昧钞棺荆慰丽亏嫁速箍鞭园漠溅故袭乾甄淖浅饺量搪珐迢龄吴飘二揽弟酣喂推摸纽蒋畦匝市然抬樱龚氯刀倚冀访医郭沟犬牌压远纬听瘩剐窖山涸窒豫榔用龚级讹阮珐伐暂轿嗣逢幢必蝇掳弗垫繁假砒纱沮剿总埃意遂成空步咎淀舞疼鬃或襟热蚕飞饥献旗州畦壹轩款瑰仓倾舀嗓蔓窝亦听世妆卜预寓柱爷心膜前旅盾伪鉴才恍当冻慕兽酣漆运陌哗归储炒酗欲碍怎真搐吼久瘁瑰公诀续心墩海懈控眉娩性肄谗省茄种度钓厄疚仿脱

3、谴悠敏疯珍丹果流庭普通生物化学实验讲义潦蓝像刑咽谣毁微奄捕队孤挟窃养填猴刨栅窥溯闪噶烯驶浑黄雪士菩啤妒乳葵备溜淋饶豆颊替闯剂塔凝映员衫周讯磷锻声羞期扫订臆废印到续快束污桂僚孵巢玲愁努玄存望巩充了律袜肃丘烦蠕境招裕轩拴潜耶板芯堵小冰朵雨什茧直疲程卖儡禄忆嵌糕猎汤逸茹坏枪嘎锅瓢鸯涤踌刁硫陈抢蓑采精车伶乌腰好忿吼沦彝宦荡块光粳最福旗辕垄频谦架狰哉贤胡村动剪旨紧以筏侥颖狐孺东摇缨聊姆泰对责抬木男珠泰癸碧骤卓哀胀严钾友努打呐疫畅罚啊眯戈蝗贬朝睬慎烯喉漓探陆产钒匠赦熔栗集光羽奈鳞斥琅嘎难岂姥决羔分却撰乞幼绅废剂筒糙畔赚抗佣厌社嚏赂鹊掀策怂庸岳玻骡硅霄屎蝶黍普通生物化学实验讲义罗志敏，林茂兹2006年12月

4、25日实验一 糖的定量 3，5二硝基水杨酸比色定糖法一、实验目的1、掌握3，5二硝基水杨酸定糖的原理与方法2、了解多糖的水解3、掌握721紫外可见分光光度计的用法二、实验原理单糖都是还原糖，均可以利用其还原性进行定量，但是双糖和多糖等则不一定就是还原糖，利用糖的溶解度不同可以把还原糖和非还原糖分离开，然后利用多糖的酸水解，使之转化为有还原性的单糖，从而可以使多糖也可以利用还原性进行定量。3，5二硝基水杨酸和还原糖共热后，被还原成棕色的化合物，颜色的深浅在一定范围内和还原糖的含量成线性关系，在540nm处进行比色测定，求出还原糖的量，进而求出总糖的含量。计算公式如下：%三、试剂1、3，5二硝基水

5、杨酸（DNS）试剂：6.3gDNS和262mL2 M NaOH加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，储存于棕色瓶中。2、6 mol/L HCl溶液3、6mol/L NaOH溶液4、标准葡萄糖溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖1g，加少量水溶解后加8mL 12 mol/L 盐酸（防止微生物生长），用蒸馏水定容至1000mL，即成1000ug/mL标准葡萄糖溶液。用该溶液和蒸馏水分别以1:9、1:4、2:3、3:2、4:1比例稀释，得到下列浓度的标准葡萄糖：100ug/mL，200 ug/mL，400 ug/mL，6

6、00 ug/mL，800 ug/mL，备用。四、器材1、试管（容量25ml以上）2、恒温水浴箱3、72型分光光度计4、马铃薯5、移液管6、pH试纸7、容量瓶8、玻璃漏斗9、10ml小量筒10、滤纸11、橡皮筋、水果刀五、操作方法（一）、标准曲线制作取7支试管编号为16，先分别加入100ug/mL、200 ug/mL、400 ug/mL、600 ug/mL、800 ug/mL、1000 ug/mL的标准葡萄糖溶液0.5mL，参比液试管中加入0.5mL蒸馏水，然后在各试管中分别加入0.5mLDNS试剂，在沸水浴中加热5min后冷却，然后各加入4mL蒸馏水，振荡均匀，测定OD540。管号每管糖含量（

7、ug）标准葡萄糖溶液DNS试剂反应蒸馏水OD540浓度（ug/mL）用量（mL）用量（mL）用量（mL）1501000.50.5沸水浴加热5min后冷却421002000.50.5432004000.50.5443006000.50.5454008000.50.54650010000.50.54700（蒸馏水）0.50.54（二）、马铃薯中还原糖和总糖的测定1、还原糖的提取：取5g马铃薯，研碎，加水2530ml置于50ml三角瓶中，将三角瓶置于50水浴保温20min后，定容至50ml，过滤，滤液备用（不必过滤完，有1.5ml以上即够用）。2、总糖的水解和提取：取1g马铃薯，研碎，转移至150m

8、L的锥形瓶中，加入6M HCl 10mL，蒸馏水15mL，沸水浴3min，冷却后用NaOH中和至pH7，定容到50mL，过滤（不必过滤完，有1mL即够用），取滤液1mL，加蒸馏水9mL稀释，备用。3、定糖：取试管6支，编号为712。按照下列表格配方加样，参比液跟上面测标准曲线时所用的一样，测定OD540（方法同上）。样品提取液（mL）DNS试剂（mL）反应蒸馏水（mL）OD5408还原糖提取液0.50.5沸水加热5min后冷却490.50.54100.50.5411总糖水解液0.50.54120.50.54130.50.54六、思考题1、比色测定操作要点及其基本原理是什么？2、比色测定为什么要

9、设计空白管？3、总糖包含哪些化合物？4、用水解后的还原糖含量计算总糖含量时为什么要乘以0.9？实验二 脂肪碘值的测定一、目的掌握测定脂肪碘值的原理和操作方法，了解测定脂肪碘值的意义。二、原理不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素（Cl2，Br2，I2）进行加成反应。不饱和键数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。在一定条件下，每100g脂肪所吸收碘的克数称为该脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。碘与脂肪的加成反应很慢，而氯及溴与脂肪的加成反应快，但常有取代和氧化等副反应。本实验使用IBr进行碘值的测定，这种试剂稳定，测定的结果接近

10、理论值。溴化碘(IBr)的一部分与油脂的不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸钠滴定。反应过程如下：（1）加成作用:RCH2-CH=CH-(CH2)n-COOH + IBr-RCH2 + CH-CH-(CH2)n-COOH（2）剩余溴化碘中碘的释放IBr + KI-I2 + KBr（3）用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘I2 + 2Na2S2O3-2NaI + Na2S4O6三、试剂和器材1试剂（1）溴化碘溶液（Hanus溶液）：取12.2g碘，放入1 500mL试剂内，缓慢加入1 000mL冰乙酸（99.5%），边加边摇，同时略温热，使碘溶解。冷却后，加溴约3mL。

11、 注意：所用冰乙酸不应含有还原性物质。检查方法：取2mL冰乙酸，加少许重铬酸钾及硫酸，若呈绿色，则证明有还原性物质存在。（2）0.1mol/L标准硫代硫酸钠溶液取结晶硫代硫酸钠50g，溶在经煮沸后冷却的蒸馏水（无CO2存在）中。添加硼砂7.6g或氢氧化钠1.6g（硫代硫酸钠溶液在pH 910时最稳定）。稀释到2 000mL后，用标准0.1mol/L碘酸钾溶液按下法标定：准确量取0.1mol/L碘酸钾溶液20mL、10碘化钾溶液10mL和1mol/L硫酸20mL，混合均匀。以1淀粉溶液作指示剂，用硫代硫酸钠溶液进行标定。按下面所列反应式计算硫代硫酸钠溶液浓度后，用水稀释至0.1mol/L。5KI

12、 + KIO3 + 3H2SO4 3K2SO4 + 3H2O + 3I22Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2NaIC(Na2S2O3)=C(KIO3)·V(KIO3)/V(Na2S2O3),单位（mol/L）（3）纯四氯化碳（4）1淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）（5）10碘化钾溶液（6）花生油或猪油2器材（1）碘瓶（或带玻璃塞的锥形瓶）（2）棕色、无色滴定管各1支（3）吸量管（4）量筒（5）分析天平四、操作步骤1准确称取0.30.4g花生油，置于干燥的碘瓶内，切勿使油粘在瓶颈或壁上。加入10mL四氯化碳，轻轻摇动，使油全部溶解。用滴定管仔细地加入25mL溴化碘溶液，勿

13、使溶液接触瓶颈，塞好瓶塞，在玻璃塞与瓶口之间加数滴10碘化钾溶液封闭缝隙，以免碘的挥发损失。在2030暗处放置30min，并不时轻轻摇动。油吸收的碘量不应超过溴化碘溶液所含之碘量的一半，若瓶内混合物的颜色很浅，表示花生油用量过多，应改称较少量花生油，重作。2放置30min后，立刻小心地打开玻璃塞，使玻璃塞旁的碘化钾溶液流入瓶内，切勿丢失。用新配制的10%碘化钾10mL和蒸馏水50mL把玻璃塞和瓶颈上的液体冲洗入瓶内，混合均匀。用0.1molL硫代硫酸钠溶液迅速滴定至浅黄色。加入1%淀粉溶液约1mL，继续滴定，将近终点时，用力振荡，使四氯化碳中的碘单质全部进入水溶液内。再滴定至蓝色消失为止，即达

14、滴定终点。另作1份空白对照，除不加油样品外，其余操作同上。滴定后，将废液倒入废液缸内，以便回收四氯化碳，计算碘值。五、结果计算碘值表示100g脂肪所能吸收碘的克数，因此样品碘值的计算如下：碘值=××100式中，A为滴定空白用去的硫代硫酸钠溶液的mL数；B为滴定样品用去的硫代硫酸钠溶液mL数；C为硫代硫酸钠溶液摩尔浓度。六、附 注 （1）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应不完全。 （2）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试剂不够，必须再添加1015 mL试剂。（3）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。（4）将近滴

15、定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如振荡不够，CCl4层会出现紫或红色，此时应用力振荡，使碘进入水层。（5）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。七、思考题1测定碘值有何意义？液体油和固体脂碘值间有何区别？2滴定过程中，淀粉溶液为何不能过早加入？3滴定完毕放置一些时间后，溶液应返回蓝色，否则表示滴定过量，为什么?实验三 氨基酸的分离鉴定纸层析法一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：Rf = 原点到层析中

16、心的距离/原点到溶剂前沿的距离；在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号)四、试剂1、扩展剂是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20 mL正丁醇和5 mL冰醋酸放人分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。2、氨基酸溶液  0.5的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均

17、为0.5)各5mL。3、显色剂50lOOmL0.1水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2、取层析滤纸(长22cm、宽14cm)一张。在纸的一端距边缘23 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。3、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm。4、扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升1520cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥

18、或用吹风机热风吹干。5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100)或用热风吹干即可显出各层析斑点。6、计算各种氨基酸的Rf值。六、注意事项1、 裁纸时长沿着与纹路垂直的方向。2、 点样时要控制好点样量。3、 层析滤纸缝成筒状时两边不能接触，而且线不要缝得太密，以免影响爬行速度。4、 放到层析缸中，要垂直放置，层析滤纸不能与层析缸壁相接触。5、 显色时，显色剂不能喷得太多，要喷均匀。七、思考题1、何谓纸层析法?2、何谓Rf值?影响Rf值的主要因素是什么?3、怎样制备扩展剂?4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么?实验四 淀粉酶粗提液的制备硫酸铵沉淀法一、实验目的1、

19、学习硫酸铵沉淀蛋白质的原理和方法；2、掌握透析、冷冻离心、酸度调节等操作。二、实验原理 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而增大，这个过程称为盐溶，但当盐浓度达到一定程度时，蛋白质的溶解度反而会随之下降，直至蛋白质的析出，此过程称为盐析。盐析现象的发生，主要是因为：蛋白质是两性物质，一定的pH下带一定的电荷，由于静电斥力的作用，使分子间相互排斥；同时，在水溶液中，蛋白质分子周围，水分子有序排列，表面上形成了水化膜，水化膜层能保护蛋白质粒子，避免其因碰撞而沉淀下来。但是当溶液中盐浓度达到一定值时，盐离子与蛋白质表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了蛋白质的电荷，而且由于中性盐的亲水性

20、比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使蛋白质沉淀出来。三、试剂及仪器1、试剂（1）无水硫酸铵（2）0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.0）称取磷酸氢二钠0.9g和柠檬酸2.75g充分溶解后，用蒸馏水定容至1000ml，再用酸度计调pH至6.02、仪器设备透析袋，冷冻离心机，50ml离心管，磁力搅拌器，电子天平四、实验步骤（1）每瓶三角瓶中加入200ml的002mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.0）在40度下浸提1小时，将浸提液抽滤得上清夜。 （2）量一定体积的浸提液，缓慢加入称好的无水硫酸铵，使之充

21、分溶解后，继续搅拌15分钟。（3）保鲜膜封口，在4度冰箱静置数小时。（4）4 8500rpm离心30min，收集沉淀，弃去上清夜，冰箱备用。五、注意事项1 加入硫酸铵时，不可太过剧烈搅拌，而且要同一方向2 硫酸铵沉淀需要在4度下进行，以免使目的蛋白变性实验五 酪蛋白的制备一、目的1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。二、原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。三、材料、试

22、剂与仪器（一）材料新鲜牛奶（二）试剂1、95%乙醇2、无水乙醚3、0.2mol/L pH4.7醋酸醋酸钠缓冲液先配A液与B液：A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL。B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。取A液1770mL，B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸醋酸钠缓冲液3000mL。4、乙醇乙醚混合液乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）（三）器具1、离心机2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计4、烧杯5、温度计四、操作步骤（一）酪蛋白的粗提50mL牛奶加热至40。在搅拌下慢慢加入预

23、热至40、pH4.7的醋酸缓冲液100mL用精密pH试纸或酸度计调节pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心10分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化1、用水洗涤沉淀 3次，分别离心10分钟（3000r/min），弃去上清液。2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗涤沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。3、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。（三）准确称重，计算含量。含量：酪蛋白g/50 mL牛乳（g%）五、注意事项1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好

24、用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。六、实验报告1、根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋白的制备方法。2、合理分析实验所用牛奶中酪蛋白的含量。七、思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？实验六 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度在提取和纯化蛋白质分子之前，必须建立测定蛋白质浓度和活性的方法。这样才能保证提高分离纯化的效率，减少产品损伤。测定蛋白质浓度的方法很多，常用的有凯氏定氮法，双缩脲法，福林酚法，紫外吸收法和考马斯亮蓝法。一、实验目的

25、1、理解考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理2、掌握蛋白质浓度测定的基本技能和注意事项二、实验原理有些染料在一定的蛋白质浓度范围内，能和蛋白质定量结合。因此可以根据染料的深浅来判定蛋白质的含量。过去人们把蛋白质样品滴加到膜材料上，然后用染料染色，再将染了色的蛋白质斑点洗脱下来，测定其光吸收值，就可以确定蛋白质的含量。1976年，M.M.Bradford发现考马斯亮蓝G250（Goomassie Brilliant Blue G250）与蛋白质结合后，它的光吸收峰会从465nm改变到595nm。因此，他把染色液直接加到蛋白质溶液中。根据OD595的变化就可确定蛋白质溶液的浓度。本法的灵敏度很高，常量

26、法可测定范围0.11.0mg/ml，微量法可测定范围为220ug/ml。本实验采用改良的方法，以达操作简易之目的。考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右达到平衡，在室温1h内稳定。在0.011.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与OD595值成正比。三、试剂1、染色液：考马斯亮蓝G250 100mg，95乙醇50ml，85磷酸100ml，溶解于无离子水，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶备用。2、 0.15M NaCl水溶液（生理盐水）3、 标准蛋白质溶液（0.

27、01浓度）：牛血清白蛋白10mg溶解于100mL0.15MNaCl水溶液中。4、 样品溶液：未知浓度的蛋白质溶液（浓度落在标准曲线范围内）四、器材1. 试管2. 棕色试剂瓶3. 量筒4. 移液管（0.5mL和1.0mL、5mL）5. 721型分光光度计五、操作方法（一）取配好的考马斯亮蓝染色液用普通漏斗过滤，过滤好了马上用，不能久置。（二）标准曲线制作取7支试管，按照下列表格配方加样，并于260min之内测定OD595。试管号1357911蛋白浓度（ug）020406080100标准蛋白（mL）00.20.40.60.81.0生理盐水（ml）1.00.80.60.40.20染色液（ml）4.0

28、4.04.04.04.04.0OD595注意：用0.5cm光程的比色皿测定，测定前将比色皿用95%乙醇泡洗，再用蒸馏水冲洗干净。（三）样品溶液中牛血清白蛋白的浓度测定取样品溶液0.5ml，加生理盐水0.5mL，染色液4.0ml，与标准曲线反应相同的时间后，测定OD595（参比溶液与标准曲线的要一致）。样品溶液蛋白质浓度求算：CBSA=m/Vm为样品OD595在标准曲线中所对应的BSA的含量（ug）V为移取的样品溶液体积（mL）六、注意事项1、 考马斯亮蓝溶液用之前要过滤。2、 试管、移液管要干燥、洁净，移液要准确。3、 先移加标准蛋白溶液，再移加生理盐水，考马斯亮蓝不要太早加入，在测吸光度前十

29、分钟左右时加，加完马上测。4、 比色皿用之前要先用95%乙醇泡洗，再用蒸馏水冲洗干净。5、 使用可见分光光度计前要先检查最大吸收波长是否调好。6、 测OD595时按BSA浓度从低到高进行测定，测之前要将待测液振荡均匀。7、 实验完毕要登记仪器使用表，清洗试管，干燥。七、思考题1、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理是什么？2、比色皿在使用前为什么要置于95%乙醇溶液中？3、能否用无离子水代替生理盐水？为什么？ 4、请设计另一种测定蛋白质浓度的方法，写出原理及其实验方案。（必做思考题）实验七 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、原理醋酸纤维薄膜电

30、泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120 um，有强渗透性，对分子移动无阻力作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。三、器材1、醋酸纤维薄膜(2×8 cm) 2、常压电泳仪 3、点样器(市售或自制) 4、培养皿(染色及漂洗用) 5粗滤纸 6、玻璃板 7、竹镊 8、白磁反应板四、试剂1、巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.07) 1000mL巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45

31、g，加水至1000mL2、染色液 300mL含氨基黑10B 0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL(可重复使用)。3、漂洗液 2000mL含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL。4、透明液300mL含无水乙醇7份，冰醋酸3份。五、操作1、浸泡。 用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟。2、点样。 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，将点样器先在放置在白磁反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端23cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品

32、。3、电泳。 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上(先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥(它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”)。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室，通电。调节电压至160V，电流强度0.40.7 mAcm(毫安厘米)，电泳时间约为25分钟、染色。 电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。、漂洗。 将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带

33、清晰的电泳图谱。定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放人透明液中浸泡23分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。六、思考题1、醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点?2、电泳图谱清晰的关键是什么? 如何正确操作?实验八  酵母核糖核酸的分离及组分鉴定一、目的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二、原理    酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性

34、乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。三、器材1乳钵    2150mL锥形瓶    3水浴    4量筒    5布氏漏斗及抽滤瓶   6吸管    7滴管    8试管及试管架    9烧杯    10离心机&#

35、160;   11漏斗四、试剂和材料10.04 mol/L氢氧化钠溶液2酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。395%乙醇                          4乙醚          

36、60;                     51.5 mol/L硫酸溶液                6浓氨水         

37、60;                   70.1 molL硝酸银溶液              8氯化铁浓盐酸溶液            

38、0;    将2mLl0%三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入到400mL浓盐酸中。9苔黑酚乙醇溶液                    6g苔黑酚溶解于100mL 95%乙醇中(可在冰箱中保存1个月)。10定磷试剂            

39、;               （1）17%硫酸溶液  将17 mL浓硫酸(比重1.84)缓缓加入到83mL水中。（2）2.5%钼酸铵溶液  将2.5g钼酸铵溶于100mL水中。（3）10g抗坏血酸溶于100 mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。（用时再配） 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合:（临用时再混合配制定磷试剂）17%硫酸溶液：2.5%钼酸铵溶液：10%抗坏血酸溶液：水=1：1

40、：1：2(V/V)。11酵母粉   五、操作 将7.5 g酵母悬浮于45mL0.04 molL氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3 000r/min)10分钟，将上清液缓缓倾人30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)5分钟。弃去清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。取200mg提取的核酸，加入1.5 mol/L硫酸溶液15mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进

41、行组分的鉴定。1、嘌呤碱  做三组对照实验：（1）取水解液1mL加入1mL浓氨水，然后加入约1mL 0.1 mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀；（2）另取1mL浓氨水，然后加入约1mL0.1 mol/L硝酸银溶液，观察有无沉淀生成；（3）取水解液1mL加入2mL浓氨水，然后加入约1mL0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。2、核糖  取1支试管加人水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2 mL。放沸水浴中3分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 3、磷酸  取1支试管，加入水解液1mL和定磷试剂ImL。

42、在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。六、思考题1、 如何得到高产量RNA的粗制品?2、 本实验RNA组分是什么?怎样验证的?实验九 维生素C的含量测定一、目的与要求： 1、 掌握2.6-二氯酚靛酚测定维生素C的原理和方法。2、 复习酸式滴定管的使用，掌握滴定操作方法。二、原理：    还原型抗坏血酸能还原染料2.6-二氯酚靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2.6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2.6-二氯酚靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。 

43、60; 三、试剂：    （1）1草酸溶液：取上述2草酸溶液500mL，用水稀释至1000mL。（2）抗坏血酸标准溶液：准确称取200mg抗坏血酸，溶于1草酸溶液中，移入lO00mL容量瓶中，并用1草酸溶液稀释至1000mL，混匀，置冰箱中保存。（3）2.6-二氯靛酚溶液：称取碳酸氢钠52mg，溶于200ml沸水中，然后称取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氢钠的溶液中，待冷，置于冰箱中过夜，次日过滤置于250ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。此液应贮于棕色瓶中并冷藏，每星期至少标定1次。四、操作方法：（一） 滴定度测定标定方法：取5m1已知浓度

44、的抗坏血酸标准溶液，加入1草酸溶液5mL，摇匀，用上述配制的染料溶液滴定至溶液呈粉红色于15秒不褪色为止。滴定10mL1%草酸，记录所耗的染料体积为V3每毫升染料溶液相当于Vc的毫克数=滴定度(T)=C×（V1-V3)/V2式中：    C；抗坏血酸(V)的浓度(mgm1)    Vl：抗坏血酸的量(m1)    V2：消耗染料溶液量(m1)（二）维生素C药片中维生素C的含量测定    1、取维生素C药片0.05g，加10mL的1草酸溶液，倒入组织捣碎机中捣碎。用1

45、草酸溶液将样品移入50mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。2、将样品液过滤，弃去最初的几毫升滤液。然后迅速吸取2ml滤液，置于50ml三角烧瓶中，用标定好的2.6-二氯靛酚染料溶液滴定之,直至溶液呈粉红色于15秒内不褪色为止。记录耗去的体积为V。3、滴定空白：取2mL1%草酸溶液，置于50ml三角烧瓶中，用标定好的2.6-二氯靛酚染料溶液滴定之,直至溶液呈粉红色于15秒内不褪色为止，记录耗去的体积为V0。4、计算：               &#

46、160;        每百克样品中抗坏血酸毫克数(V-V0)×T×100/WV：滴定样品液时所耗去染料溶液的量(mL)；V0：滴定空白液时所耗去染料溶液的量(mL)；    T：lmL染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量(mg)W：滴定时所取的滤液中含样品量(g)五、注意事项    （1）所有试剂配制最好用重蒸馏水。    （2）样品取样后，应浸泡在已知量1草酸溶液中以免使抗坏血酸发生氧化，受损失。 

47、60;  （3）对动性的样品可用10三氯醋酸代替2草酸溶液提取；对含有大量Fe的样品，如储藏过久的罐头食品可用8醋酸溶液代替草酸溶液提取。    （4）整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。    （5）若样品滤液无色，可不加色陶土。样品滤液为有色的，可加白陶土脱色过滤，滤液要迅速滴定，要对每批新的白陶土测定回收率。    （6）滴定开始时，染料溶液要迅速加入，直至红色不立即消失而后尽可能一滴一滴地加入，并要不断振动三角烧瓶，直至溶液呈粉红色于15秒内不消失为止。样品中可能有其他杂质也能

48、还原2.6-二氯靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢，所以滴定时以15秒钟红色不褪色为终点。    （7）测定样品溶液时必须同时作一空白对照，样品溶液滴定的毫升数须扣除空白液滴定的毫升数。实验十 植物叶片中硝酸还原酶活性测定硝酸还原酶（Nitrate reductase, NR）是植物氮素代谢作用中关键性的限速酶，与作物吸收和利用氮素有关，可以将还原为。硝酸还原酶活性（Nitrate reductase activity, NRA）易受环境因素的影响，轻微的水分胁迫即可使NRA急剧下降，导致植物对硝态氮的同化速率降低，影响到整体的氮素代谢和其他代谢过程.

49、 有研究表明：水分胁迫且充足供氮时，小麦叶片硝酸还原酶活性降低幅度较小，水分胁迫且不供氮时，叶片硝酸还原酶活性几乎检测不出来。硝酸还原酶活性对作物抗旱性能有一定相关性，被一些学者用于作物抗旱性能的指标。一、实验目的1、理解酶活性测定的一般原理2、掌握硝酸还原酶活性测定的技能和注意事项3、理解酶活性对外界环境的依赖二、实验原理酶是催化剂，可以将底物催化反应成新产物。酶的活性也叫做酶活力，是指酶催化一定化学反应的能力，可以用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。硝酸还原酶可以将还原为，而与磺胺盐酸盐及 N 萘基乙二胺盐酸盐溶液反应后显红色，该反应在540nm波长处有较大的吸收峰，

50、且颜色深度和浓度成一定比例。所以，可以将新鲜的植物组织（含有硝酸还原酶）加入含的溶液中，反应一段时间后再加入对氨基苯磺酸及 N 萘基乙二胺盐酸盐溶液，反应一段时间后，测定单位时间、单位体积（可以转化为植物组织的单位质量）中产物的浓度，用以表示植物组织中硝酸还原酶的活性。所检测的单位时间、单位质量的植物组织所在的反应体系中浓度越高，说明该植物组织中硝酸还原酶活性越高。三、试剂1、0.1 M pH7.5磷酸缓冲液：A液（0.2mol/L Na2HPO4）：称取35.61g Na2HPO4·2H2O（A.R），用蒸馏水溶解并定容至1 000mL。B液（0.2mol/L NaH2PO4）：称

51、取NaH2PO4·H2O（A.R）27.6g，用蒸馏水溶解并定容至1 000mL。取A液84.0mL和B液16.0mL，混匀，加蒸馏水100mL。用酸度计测定其pH，并用HCl或NaOH溶液校正至pH7.5。2、标准NaNO2溶液：精确称取NaNO20.1000g，用水溶解后定容至100mL，吸取此液5mL，用水稀释定容至1000mL，即为5g/mL的NaNO2标准液。3、0.04MKNO3溶液：称取10.11gKNO3（A.R）溶于磷酸缓冲液并定容至500mL。4、1对氨基苯磺酸溶液:称1g对氨基苯磺酸，加25mL浓盐酸，用水定容至100mL。5、0.2N萘基乙二胺盐酸盐溶液: 称

52、0.2g -萘胺，加25mL冰乙酸，用水定容至100mL。置于棕色瓶中保存。6、30%三氯乙酸：75.0g三氯乙酸用水定容至250mL。7、待测实验材料：白菜叶片，油菜叶片，玉米叶片等任选一种，也可选择其他作物叶片。四、器材1、72型分光光度计2、1cm光程比色皿3、三角瓶4、试管及试管架5、移液管6、容量瓶7、真空泵8、离心机9、恒温箱五、操作方法（一）标准曲线制作取6支试管编号，按照下列表格中的配方加样并摇匀，反应20min后测定OD540。以NaNO2含量（ug）为横坐标，OD540为纵坐标，做出标准曲线。123456标准NaNO2溶液（ml）00.40.81.21.62蒸馏水（ml）2

53、1.61.20.80.401对氨基苯磺酸溶液（mL）4444440.2N萘基乙二胺盐酸盐溶液（mL）444444反应时间（min）202020202020NaNO2含量（ug）0246810OD540（二）酶反应和酶活性测定将待测实验材料用水洗净，再用蒸馏水冲洗，然后用滤纸吸干。将材料剪成0.5cm × 0.5cm左右的小块，混合均匀后分别称取6份，每份1g，然后分别放入6支试管中，并按照下列表格配方加样。1234560.1 M pH7.5磷酸缓冲液（mL）4.04.04.04.04.04.00.04 M KNO3溶液（mL）5.05.05.05.05.05.030%三氯乙酸（mL）

54、1.0001.000将上述配方加样的各个三角瓶中的溶液摇匀，将三角瓶取出放入恒温箱，13号置于在30、暗条件下保温30min，46号置于自然光下在300C保温30min。取出后立即向2、3、5、6号瓶分别加入1mL 30%三氯乙酸以终止酶反应。将各瓶中的反应液离心（2000r/min，10min），然后分别吸取上清液2mL于另一试管中，各加入4mL 1%对氨基苯磺酸溶液和4mL 0.2% N萘基乙二胺盐酸盐溶液，室温显色20min后测定540nm波长下的光密度。分别以1号和4号三角瓶的反应液作为空白，读出2、3、5、6号三角瓶中反应液的OD520。得到的值在标准曲线上查出相应的NaNO2含量（

55、g）。硝酸还原酶活性计算六、注意事项1、硝酸还原酶是诱导酶，光照是其诱导条件之一，所以应在光合作用进行了一段时间以后（3h）采样，田间采样应在早晨9点钟以后。2、无机磷对硝酸还原酶活力有促进作用，所以常用磷酸缓冲液。3、在配制标准溶液时，加入亚硝酸钠标准液和蒸馏水后要摇匀。显色时，加入1%对氨基苯磺酸后应充分摇匀。4、配好的KNO3磷酸缓冲液应密闭低温保存，否则易滋生微生物将NO3-还原，使对照吸光值偏高。5、硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。七、思考题1、为什么1、4号三角瓶在加入样品之前就要先加入1.0ml 30%三氯乙酸？2、自然光照下和暗条件下实验结果有何不同？为什

56、么？3、 酶活力的定义？如何测定硝酸还原酶的活性？请另外设计一种测定硝酸还原酶活力的方法？4、 试讨论测定硝酸还原酶活力的影响因素？实验十一 核酸的提取及性质鉴定（生物化学设计性实验）核酸的提取及性质鉴定是生命科学领域的一项基本技术，对于不同的物种和材料，提取和鉴定核酸的方法不同。本实验要求学生利用自己所学的知识和查阅的资料，设计一套可行的方案，从自选的材料中提取核酸并对性质进行鉴定。 一、实验目的 1、掌握不同方法从物种中分离核酸的基本原理 2、根据基本原理自行设计一套从不同组织、细胞中分离核酸并定量测定的方案,掌握各实验方法. 3、掌握核酸分离的基本操作并对比不同方法之间的优缺点 4、掌握

57、核酸纯度和含量检测方法二、实验条件 实验可以在本系生物化学实验室完成。实验室提供基本的实验器材和实验药品。 三、实验要求 1、广泛查阅文献和资料，了解课题目前国内外的研究状态2、根据自己查阅的资料确定合适的材料3、提交实验可行性报告（1）实验原理 （2）自行确定实验材料的依据（3）自行设计实验步骤及其依据（包括核酸提取的具体方法；电泳方法、纯度和含量鉴定方法）（4）自己所选药品的配制,叙述具体方法（5）预期实验结果4、撰写实验报告，内容包括：（1）实验题目；组员姓名；班级；指导教师姓名（2）摘要；关键词（3）综述（实验原理和研究进展） （4）材料与方法 （5）实验结果 （6）结果分析 （7）问题与讨论（8）参考文献四、实验说明 核酸是构成生物有机体的主要成分，在生物体中它们结合成核蛋白的形式存在。由于核酸极不稳定，在较剧烈的化学、物理因素和酶的作用下很容易降解，因此制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用,因此在设计实验方案时应特别注意。核酸是一类带电的大分子，同时核酸极其衍