细胞因子检测技术学习教案

1、会计学1第一页，共32页。细胞因子（细胞因子（cytokine, CK）指由免疫细）指由免疫细胞或非免疫细胞（血管内皮细胞、成纤维胞或非免疫细胞（血管内皮细胞、成纤维细胞等）合成与分泌的，具有多种生物功细胞等）合成与分泌的，具有多种生物功能的小分子蛋白质的统称能的小分子蛋白质的统称(tngchng)。因。因能调节多种细胞的生理功能而得名。可介能调节多种细胞的生理功能而得名。可介导细胞与细胞之间相互作用，介导炎症反导细胞与细胞之间相互作用，介导炎症反应，参与免疫应答和组织修复等。应，参与免疫应答和组织修复等。细胞因子一、细胞因子概述一、细胞因子概述(i sh)第1页/共32页第二页，共32页。以

2、生物学作用以生物学作用(zuyng)进行划分的进行划分的分类分类白细胞介素（Interleukin） IL-1、IL-2、 IL-18干扰素（Interferon） IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子(ynz)（Tumor necrosis factor） TNF- 、 TNF- 集落刺激因子(ynz)（Colony-stimulating factor） M-CSF、G-CSF转化生长因子(ynz)（Transforming growth factor） TGF- 趋化因子(ynz)（Chemokine） IL-8、GROs、MCP-1生长因子(ynz)（Growth factor）

3、EGF、FGF、IGF、PDGF第2页/共32页第三页，共32页。 细胞因子间的相互作用细胞因子间的相互作用IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、 GM-CSFTNF TGF IL-1 IFNIL-1 IFNTNFIL-1 TGFIFNIL2 IL-4IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6TNF IFN IL-1 TGFTNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSFTNFTNF IL-1 TGFIL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IL-1 IL-6IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN内皮细胞成纤维细胞TB第3页

4、/共32页第四页，共32页。 二、 细胞因子检测(jin c)的方法与原理（一）细胞(xbo)生物学检测（二）免疫学检测（三）分子生物学检测第4页/共32页第五页，共32页。1、细胞增殖或增殖抑制试验(shyn)2、细胞毒活性测定3、抗病毒活性测定法4、细胞趋化活性测定法（一）细胞（一）细胞(xbo)生物生物学检测学检测第5页/共32页第六页，共32页。第6页/共32页第七页，共32页。 通过检测细胞通过检测细胞DNADNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，增殖过程中，DNADNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多

5、，若将合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以核苷标记上可以(ky)(ky)示踪的同位素（示踪的同位素（3H/125I 3H/125I ），通过检测细胞内的），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。结果客观结果客观(kgun)(kgun)易于易于自动化；适用于大标本量自动化；适用于大标本量的测定的测定 方法的特异性受依赖细胞方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染株影响；放射性污染(1) (1) 放射性核素掺入法放射性核素掺入法第7页/共32页第八页，共32页。特点：不使用放射性核素，特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢

6、以细胞代谢(dixi)(dixi)变化为增殖指征变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢指示细胞的增殖情况与线粒体代谢(dixi)(dixi)活性相关活性相关 测定步骤测定步骤(bzhu)(bzhu)类类似似与同位素掺入法相比与同位素掺入法相比(xin b)掺入物：掺入物：MTTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同培养时间不同(2) MTT (2) MTT 比色法比色法第8页/共32页第九页，共32页。本法本法(bn f)常用于常用于TNF等的测定等的测定第9页/共32页第十页，共32页。Wish、Hep2/c

7、 人干扰素人干扰素L929 小鼠干扰素小鼠干扰素Ratec 大鼠干扰素大鼠干扰素A549MDBK 多种族多种族(zhngz)的的IFN-和和IFN-本法常用于本法常用于IFNIFN等的测定，等的测定，IFNIFN可诱导细胞可诱导细胞(xbo)(xbo)产生抑制病毒产生抑制病毒RNARNA和和DNADNA合成的酶，保护细合成的酶，保护细胞胞(xbo)(xbo)不受病毒感染，产生细胞不受病毒感染，产生细胞(xbo)(xbo)病病变效应（变效应（CPECPE）。）。 VSV、EMCV及及Sindbis virus等等细胞病变效应细胞病变效应(CPE)、抑制抑制(yzh)病毒蚀斑形成或抑制病毒蚀斑形成

8、或抑制(yzh)病毒的产量病毒的产量3 3、抗病毒活性测定法、抗病毒活性测定法常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于攻击细胞的病毒常用于攻击细胞的病毒检测抗病毒活性的方法检测抗病毒活性的方法第10页/共32页第十一页，共32页。趋化性趋化性(chemotaxis)(chemotaxis)： 诱导诱导(yudo)(yudo)细胞向由趋化因子低浓度处向趋化因子细胞向由趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处作定向移动的特性高浓度处作定向移动的特性, ,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。验。化学增活性化学增活性(chemokinesis)(chemokin

9、esis)： 细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性, ,可采用琼脂糖可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。小滴化学动力学试验检测。趋化因子诱导趋化因子诱导(yudo)(yudo)细胞移动的方式细胞移动的方式4 4、趋化活性测定法、趋化活性测定法第11页/共32页第十二页，共32页。滤膜：计数(j sh)受趋化细胞趋化因子细胞(xbo)趋化试验趋化试验(shyn)原理示意原理示意第12页/共32页第十三页，共32页。靶细胞的选择靶细胞的选择(xunz)与培养与培养1、对所测的细胞因子有特异的敏感性2、易培养、保存、生物学特性稳定3、有良好(lingho)的生长状

10、态4、种属适配第13页/共32页第十四页，共32页。各类细胞因子检测各类细胞因子检测(jin c)的常用的常用靶细胞靶细胞细胞因子 实验系统 干扰(gnro)因素IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4第14页/共32页第十五页，共32页。各类细胞因子检测各类细胞因子检测(jin c)的常的常用靶细胞用靶细胞细胞因子

11、 实验系统 干扰因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性(zhngxng)粒细胞（M、H）趋化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/ L929 （M、H）细胞毒法IFN wish（H）病变保护法 IFN- 、 IFN- L929（M）病变保护法 IFN- 、 IFN- 第15页/共32页第十六页，共32页。敏感性较高敏感性较高特异性不高特异性不高操作操作(cozu)(cozu)繁琐繁琐易受干扰易受干扰生物学活性测定方法学评价生物学活性测定方法学评价(p

12、ngji)(pngji)第16页/共32页第十七页，共32页。（二）免疫学检测（二）免疫学检测(jin c)细胞因子(或受体)与相应(xingyng)的特异性抗体( 单克隆抗体或多克隆抗体)结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示， 从而定性或定量显示细胞因子(或受体)的水平。1、ELISA法2、酶联免疫斑点实验3、流式细胞分析法第17页/共32页第十八页，共32页。1 1、ELISAELISA方法方法(fngf)(fngf)ELISAELISA法是应用最为广泛法是应用最为广泛(gungfn)(gungfn)的非均相酶标免疫分的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶

13、促反应构成析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISAELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISAELISA法不仅可以法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定粘附因子的测定 第18页/共32页第十九页，共32页。敏感性偏低敏感性偏低不能判断不能判断(pndun)(pndun)细胞因子的生物学活性。细胞因子的生物学活性。ELISAELISA特异、简便特异、简便易于推广易于推广(tugung)(tugung)和标准化等优点和标准化等优点可同时检测大量标本且

14、试验废弃物便于处理可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法细胞因子测定的首选方法第19页/共32页第二十页，共32页。2 2、酶联免疫斑点试验、酶联免疫斑点试验(shyn)(ELISPOT(shyn)(ELISPOT或或ElisaSpot) ElisaSpot) 在包被有待测细胞因子抗体在包被有待测细胞因子抗体(kngt)(kngt)的微孔板的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体于其周围，并被

15、板上的特异性抗体(kngt)(kngt)捕获。捕获。后续的反应如同后续的反应如同ELISAELISA，即在洗去细胞后视用于试验，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体的酶标抗体(kngt)(kngt)为一抗或二抗，分别作直接或为一抗或二抗，分别作直接或间接法。间接法。 一个斑点代表一个细胞一个斑点代表一个细胞(xbo)(xbo)因子分泌细胞因子分泌细胞(xbo)(xbo)，斑点的颜色深浅程度与细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞(xbo)(xbo)分泌的细胞分泌的细胞(xbo)(xbo)因子量相关因子量相关 基基本本原原理理第20页/共32页第二十一页，共32页。ELISPOT第21页/共32页第二十二

16、页，共32页。3 3、流式细胞分析法、流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测粘附分子的检测(jin c)(jin c)，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测(jin c)(jin c)，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。精确判断不同

17、细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。 1 1分离和培养待检细胞分离和培养待检细胞(xbo) (xbo) 2 2细胞细胞(xbo)(xbo)固定固定 3 3封闭非特异性结合位封闭非特异性结合位点点 4 4染色与分析染色与分析 基本基本(jbn)步骤步骤第22页/共32页第二十三页，共32页。细胞细胞(xbo)内细胞内细胞(xbo)因子检测技术因子检测技术激活(j hu)膜抗原(kngyun)标记细胞内细胞因子标记第23页/共32页第二十四页，共32页。使用使用(shyng)(shyng)流式细胞分析法，可以：流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1

18、Th1细胞细胞 IFN- IFN- Th2 Th2细胞细胞 IL-4 IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：细胞表面的粘附分子或细胞因子受体： 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 直接或间接直接或间接(jin ji)(jin ji)荧光抗体染色荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态第24页/共32页第二十五页，共32页。免疫学测定方法学评价免疫学测定方法学评价(pngji)(pngji)优点：优点： 特异性高特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株操作

19、简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。化。缺点：缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其(yq)(yq)生物活性不一定呈正比生物活性不一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合对细胞因子的结合第25页/共32页第二十六页，共32页。（三）分子生物学检测（三）分子生物学检测(jin c)此方法测定此方法测定(cdng)的并非细胞因子本身，的并非细胞因子本身，而是