抗菌药物耐药性的分子生物学机制

1、抗菌药物耐药性的分子生物学机制    关键词：生物学机制 抗菌药物产生耐药性，为人类战胜病原菌提出了一个严峻的挑战。细菌耐药的机制非常复杂，通常认为涉到以下几个方面:（1）产生灭活酶和钝化酶。细菌能产生可破坏抗生素或使之失去抗菌作用的酶，使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。（2）抗菌药物渗透障碍 1  。细菌外层的细胞膜和细胞壁结构对阻碍抗生素进入菌体有着重要作用。膜上有亲水性的药物通过蛋白，称外膜蛋白，主要有2种:分子较大的为OmpF和分子较小的为OmpC;最近又发现了第三种蛋白PhoE。外膜蛋白的缺失可导致细菌耐药性的发生，在某些细菌的外膜

2、上还有特殊的药物泵出系统，使菌体内的药物浓度不足以发挥抗菌作用而导致耐药。（3）药物使用靶位的改变。菌体内有许多抗生素结合的靶位，细菌可通过靶位的改变使抗生素不易结合，是耐药发生的重要机制。（4）代谢途径改变。绝大多数细菌不能利用已有的叶酸及其衍生物，必须自行合成四氢叶酸。肠球菌属等某些营养缺陷型细菌能利用外源性胸苷或胸腺嘧啶，表现出对磺胺和甲氧嘧啶等药物的耐药。从分子生物学角度认识细菌的耐药机制，过去主要集中在基因突变的研究中，认为基因突变的积累是细菌产生耐药性的重要机制。但近年来研究发现，没有接触过抗生素的病原菌，对抗生素也具有抗性，耐药性具有转移的特点。整合子（integron）被认为是

3、抗性基因在水平传播的重要因子 3  ，由两部分组成:5与3端保守区域（conserved segments，简称CS）以及中间的基因簇，选择性地整合到整合子上而获得耐药性。通过整合子的整合作用，抗性基因之间能够互相交换，再借助于转化、转导与接合作用，使得耐药性在畜禽与畜禽、畜禽与人类、人类与人类之间的病原菌上广泛传播，给人类健康造成严重威胁。1 细菌对-内酰胺类抗生素的耐药机制-内酰胺类抗生素为高效杀菌剂，对人的毒性极小。其中革兰阳性细菌产生的耐药主要通过青霉素结合蛋白（PBP）的改变介导，而革兰阴性细菌产生的耐药则主要通过-内酰胺酶介导。1.1 PBP改变介导的细菌耐药 青霉素结合

4、蛋白（penicillin binding proteins，PBP）位于细菌细胞质膜外壁，是细胞壁肽聚糖合成后期具有转肽酶、转糖苷酶及羧基肽酶等作用的一系列酶，也是-内酰胺类抗生素的作用靶点。当-内酰胺类抗菌药物与PBP结合后，PBP便失去酶的活性，使细胞壁的合成受到阻碍，最终造成细胞溶解、细菌死亡 8  。-内酰胺类抗生素的抗菌活力，一是根据与PBP亲和性的强弱，二是根据其对PBP及其亚型的选择即对细菌的作用特点而决定的。PBP基因的变异，使-内酰胺类抗生素无法与之结合或结合能力降低，是形成耐药的根本原因。PBP改变包括获得的对抗生素低亲和力的PBP和本身发生修饰导致对抗生素的亲

5、和力下降的PBP，前者主要发生在葡萄球菌中，后者主要发生在肺炎链球菌中。PBP按分子量的不同分为5种，每种又有若干亚型。PBP1A、PBP2X、PBP2B的基因排序已经证明13个位点基因变异，位点变异造成PBP结构变化，使-内酰胺类抗生素不易与之结合，使其之间的亲和力下降，导致抗菌力低下。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对所有-内酰胺类抗生素均耐药，其原因是由于获得了未知起源DNA编码的新的耐-内酰胺PBP，这种PBP由细菌染色体mecA基因编码，被命名为PBP2a。mecA基因的表达受多种因素的影响，包括pH、温度、渗透性、上游调节序列和抗生素的诱导。mecA的转录有3种形式:非诱导持续

6、表达型，此型MRSA缺少mecR1-mecI基因和-内酰胺酶质粒;即刻诱导型，此型缺少mecR1-mecI基因而具有-内酰胺酶质粒，通过-内酰胺酶的调控基因来调控mecA的表达;延迟表达型，此型MRSA具有mecR1-mecI基因，其耐药性在甲氧西林诱导后48h才能充分表达，临床常规药敏试验常误将此型菌株判断为敏感，因此具有重要的临床意义。1.2 -内酰胺酶介导的细菌耐药 现已发现4种新的临床上重要-内酰胺酶 4  :超广谱-内酰胺酶（extended-spectrum-lactamases，ESBLs）;金属-内酰胺酶;质粒介导的AmpC-内酰胺酶;OXA型-内酰胺酶。1.2.1

7、超广谱-内酰胺酶（ESBLs） ESBLs属于Bush分类法的A组，最早由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生，由质粒介导，从TEM、SHV突变而来。临床对-内酰胺类药物耐药者包括青霉素类、第三代和第四代头孢霉素以及氨曲南，但对酶抑制剂敏感。ESBLs种类最多的是TEM族酶（已超过90种）、SHV族酶（已超过25种）和CTX-M族。TEM族超广谱-内酰胺酶:TEM-1是革兰阴性菌最常见的-内酰胺酶。超过90%大肠埃希氏菌对氨苄西林耐药的原因是由于其产TEM-1。越来越多耐氨苄西林和青霉素的流感嗜血杆菌，淋病奈瑟氏球菌也产TEM-1。TEM-1能水解青霉素和头孢噻吩、头孢拉定等第一代头孢菌素

8、。发生在个别位点的氨基酸取代对ESBLs表型至关重要。Glu-104Lyx，Arg-164Ser/His，Gly-238Ser及Glu-240Lys。SHV族超广谱-内酰胺酶:产SHV-1最常见的细菌是肺炎克雷伯杆菌。肺炎克雷伯杆菌质粒介导的氨苄西林耐药的原因超过20%是其产SHV-1。Ser-238Gey及Lys-240Glu是SHV型ESBLs的最常见情况。CTX-M族超广谱-内酰胺酶。近年来，一个新的质粒介导的ESBLs家族CTX-M（以高度水解头孢噻肟为特征）的数量也在不断增加。这类酶主要由鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌或肠杆菌属某些种产生，包括CTX型酶和Toho-1，2。CTX-M型酶对

9、头孢噻肟、头孢他啶的水解能力比对青霉素强，相对头孢他啶来说，更优先水解头孢噻肟。尽管这族酶中的一些也能水解头孢他啶，但通常不引起临床耐药。所有CTX-M族酶都有Ser 237  ，提示该位点对其超广谱酶活性起重要作用。驱动ESBLs进化的选择压力通常要归因于氧亚胺-内酰胺类抗生素的使用强度。-内酰胺类抗生素的强选择压力不仅对ESBLs基因的编码区而且对启动子、拷贝数以及其它基因起作用。这些改变可明显增加菌株的耐药水平和扩大底物谱。细菌高产ESBLs通常是诸如启动子上调突变，可转座因子插入启动子区域附近，ESBL基因拷贝数增加或产生2种不同的ESBLs等原因造成。目前，已发现不少菌株产

10、ESBL同时伴有AmpC酶去阻遏突变。产ESBL菌株常常也对氨基糖苷类、喹诺酮类等其它类抗菌药物耐药。编码ESBLs的基因常与编码氨基糖苷类纯化酶的基因在同一接合性质粒上，因而可以一起在菌株间传播。这意味着只使用其中一类抗菌药物便可产生对2类不同药物耐药性的共选择。1.2.2 金属-内酰胺酶 属于Bush分类法的B组，是一组活性部位为金属离子，且必须依赖少数金属离子（主要为Zn 2+  ）存在而发挥催化活性的酶类。大多数编码金属酶的基因序列已被确认，包括来源于脆弱类杆菌的cfiA基因、腊样芽孢杆菌的Bc-基因、嗜麦芽寡食单胞菌的L-1基因、以及铜绿假单胞杆菌及粘质沙雷菌为主的部分革兰

11、阴性杆菌携带的IMP基因和VIM基因。除IMP及VIM外，几乎所有的金属酶编码基因都位于染色体上，其中cfiA基因和L-1基因的表达与药物诱导有关。TMP-1基因是目前所有金属酶基因研究的热点，介导IMP-1基因水平传递的机制已基本明确，即IMP-1基因位于可移动的基因元件整合子上。一个整合子可捕获多个基因盒（gene cassette），目前已发现60多种基因盒，大多为耐药基因，除TMP-1金属酶基因盒外，还有与-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素及磺胺类抗菌药物耐药有关的基因盒，新近发现部分超广谱-内酰胺酶基因也存在于整合子上，这些基因借助于整合子上的启动子得以转录、表达、并可能介导细菌的多重耐

12、药性。1.2.3 AmpC-内酰胺酶 质粒AmpC酶可见于克雷伯菌、沙门菌、弗劳地枸橼酸杆菌、产气肠杆菌、奇异变形杆菌和大肠埃希菌等，常携带大质粒，同时编码对其它抗生素的耐药性，表现为对第一三代头胞菌素、头霉素、氨基糖苷类及抗假单胞菌青霉素均耐药，但对碳青霉烯类、四代头孢和氟喹诺酮类敏感。现已报道的AmpC酶至少有25种，根据遗传学关系，可分为5个家族:枸橼酸杆菌起源的LAT-族（包括LAT-14、CMY-29和BIL-1）;未知起源的FOX-族（包括FOX-16、CMY-1、MOX-12和CMY-8）;阴沟肠杆菌起源的Entb-族（包括MIR-1、ACT-1）;摩根菌起源的Morg-族（目前

13、仅发现DHA-1一个酶）;蜂房哈夫尼起源的Haf-族（ACC-1）。产CMY-1和MOX-1酶的菌株对头孢他啶的MICs比头孢噻肟小，而其它类型的AmpC-内酰胺酶对头孢他啶和头孢噻肟的MICs值相等。1.2.4 OXA型内酰胺酶 OXA型内酰胺酶以高度水解苯唑西林、氯唑西林、活性被克拉维酸仅轻微抑制为特 征。OXA型酶主要由铜绿假单胞菌产生，产赋予细菌对头孢他啶等氧亚胺头孢菌素高水平耐药，当将其编码基因转化大肠埃希氏菌时则对氧亚胺头孢菌素呈微弱耐药。OXA型酶可被氯离子强烈抑制，100mmol/L的氯离子可以完全抑制OXA型酶的活性。OXA型酶的耐药性与整合子有关。大多数肠杆菌科细菌和假单孢

14、菌中的OXA型酶位于可转移质粒上，质粒能携带可移动元件转座子。有些转座子只编码单个耐药性，编码多重耐药的质粒和转座子常常还有另一基因元件，即整合子。整合子是一个遗传结构，可位于质粒、染色体或转座子上，具有整合独立的耐药基因盒的能力。基因盒中存在整合子可解释为什么质粒可积累不同的耐药基因，为什么OXA型酶常与其他抗生素耐药性关联。2 细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制氨基糖苷类抗生素因其具有浓度依赖性快速杀菌作用、与-内酰胺类抗菌药物产生协同作用、细菌的耐药性低、临床有效和价廉等优点，它仍是目前临床常用药物，广泛用于革兰阴性杆菌所致的败血症、细菌性心内膜炎和其它严重感染。其作用机制是通过抑制细菌细

15、胞膜蛋白质的合成并改变膜结构的完整性而发挥强有力的杀菌作用。对生长繁殖旺盛的细菌，氨基糖苷类通过细菌的细胞外膜扩散后，与其内（细胞质）膜上具有跨膜摄取功能的一种能量依赖性（限速）转运系统“I相转运”蛋白呈低亲和力结合;敏感细菌与其胞膜相连的核蛋白体30S亚基的高亲和力位点上不断集聚药物，由此触发第二种能量依赖性转运系统“II相转运”而明显加速药物在细胞内的集聚，抑制细菌蛋白质合成，破坏细胞质膜结构，导致细菌内容物外漏直至细菌死亡 8  。细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药性的机制牵涉到以下几个方面:2.1 药物摄取的减少 氨基糖苷类药物主要通过寡核系统转运至体内，寡核结合蛋白（oligo

16、peptide binding protein，OPPA）是寡核转运系统的重要组成部分，而大肠埃希氏菌耐卡那霉素突变株的OPPA数目明显减少，有的突变株甚至不含OPPA。前者是因为在翻译水平上OPPA发生了OPPA合成的减少，后者则是由于编码OPPA的基因OPPA发生了无义突变。2.2 酶的修饰钝化作用 这是细菌对氨基糖苷类抗生素发生耐药的主要机制。氨基糖苷类药物修饰酶催化氨基糖苷类药物氨基或羟基的共价修饰，使得氨基糖苷类药物与核糖体的结合减少，促进药物摄取EDP-II也被阻断，因而导致耐药。根据反应类型，氨基糖苷类药物修饰酶有N-乙酰转移酶（N-acetyltransferases，AAC）、0-核苷转移酶（0-nucleotidyltransferase，ANT）和0-磷酸转移酶（0-phosphotransferases，APH）。这些酶的基因决定族即使在没有明显遗传关系的细菌种群间也能传播。AAC以乙酰辅酶A为供体，乙酰化氨基糖苷类药物的1、3、6、2位氨基，而APH和ANT两者均以ATP为供体，APH作用于氨基糖苷类药物的3位和4位、3和6位-OH，ANT作用于氨基糖苷类药物的2、4位和3位、6位、9位-OH使之磷酸化，从而使氨基糖苷类药物钝化。2.3