探讨调节蛋白表达的影响

1、探讨调节蛋白表达的影响    摘要：  目的 探讨失血性休克大鼠TM、TM mRNA的变化机制及参附的干预作用的研究。 方法 SD大鼠分成：假休克组，休克组，林格液复苏组，参附复苏组。休克及复苏2h 后，处死大鼠取出肝脏, Western blotting法测TM 变化，用RTPCR法测TM mRNA的变化。结果 假休克组有 TM 、TM mRNA表达。休克组、林格液复苏组TM 表达下降，TM mRNA表达上调，与假休克组比较有显著统计学意义。参附复苏组TM 表达上调，TM mRNA 表达显著下调恢复，与假休克组比较无统计学意义，与休克组、林格

2、液复苏组比较有显著统计学意义。结论 失血性休克TM 蛋白表达下降，TM mRNA表达上调，与休克损伤有关。林格液对蛋白C激活系统表达无明显调节作用。参附通过对内皮细胞的保护作用，具有抗休克作用。 关键词：  失血性休克 凝血酶调节蛋白 参附注射液创伤死亡的首要原因是失血性休克。2007年欧洲重症监护医学协会、欧洲休克协会等专家发表控制大创伤后出血的治疗指南，指出大出血患者常由血管损伤及凝血功能异常所致。血管内皮细胞的主要功能为抗血栓形成,这也是维持血液流动性的重要机制之一。PC系统发挥抗凝作用与血管内皮细胞上的凝血酶调节蛋白(thrombomodulin, TM) 、内皮细胞蛋白C

3、受体(endothelial protein C receptor, EPCR) 及血浆中的蛋白C(protein C,PC) 等有关。该系统是凝血酶生成后对凝血系统活化有负反馈作用的一个调节系统，不仅具有抗凝作用，而且在抗炎过程中发挥作用，当前重组人活化蛋白C对脓毒症休克的治疗已经取得了突破性的进展。阐明PC系统在失血性休克的紊乱机制，对失血性休克的治疗及预后具有重要意义。作者2008年1至5月通过研究建立失血性休克大鼠模型，用Western blotting法检测肝脏内皮细胞TM 的表达水平，用RT-PCR法测TM mRNA的表达水平，观察失血性休克抗凝系统变化机制及参附的干预作用。

4、60;   1  材料与方法      1.1  一般资料  选用温州医学院动物中心提供的Sprague Dawley(SD)大鼠40只，体重250300。随机分为4组：假休克组(A组)，失血性休克组(B组)，林格液复苏组(C组)，参附复苏组(D组)，每组10只。按Lamson的方法，改良后复制失血性休克动物模型。除A组外，其余大鼠均放血至40mmHg维持60 min，B组不复苏，C组用3倍失血量的林格液复苏；D组用含参附注射液 (10ml/kg)和林格液组成的3 倍失血量的液体复苏。休克及复苏2h 后，

5、处死大鼠，立即取出其肝脏。    1.2  方法  （1）Western blotting法检测大鼠肝脏组织匀浆TM 含量：制备蛋白质样品，经SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE），转膜，加TM小鼠单克隆IgG 抗体（Santa Cruz公司提供）与抗原结合，加辣根过氧化物酶标记的TM山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技术研究所提供）与一抗的结合，用联苯胺显色，Image master VDS成像系统摄影存盘后应用计算机图像分析软件(Quantity one 4.4.0)行灰度扫描分析。以目的基因与-actin的条带灰度之比作为反映相对指标。(

6、2)RTPCR法检测大鼠肝脏组织匀浆TM mRNA含量：取肝组织约100mg, 以Trizol试剂盒一步法提取细胞总RNA , 采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT -PCR ) 技术对转录产物进行扩增, 扩增产物经质量分数为2% 的琼脂糖凝胶电泳后照相。电泳结果采用计算机图像分析系统(Gel-pro) 进行扫描, 以灰度值表示电泳带的强度。PCR所用引物采用Primer5.0计算机软件设计，用BLAST验证。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成提供。    1.3  统计学处理  数据以均值±标准差（x±s)表示，采用S

7、PSS 12.0统计软件包处理，多组间相同指标的比较采用单因素方差分析，如差异有统计学意义则进一步行组内两两间比较，方差齐时采用LSD检验采用Student Newman Keuls法，方差不齐者采用Tamhanes法。P0.05为差异有统计学意义，P0.01为差异有显著统计学意义。    2  结果    A组大鼠肝组织有TM 、TM mRNA 表达。B组肝组织TM 表达下降， TM mRNA表达上调，与A组比较有显著统计学意义（P<0.01）。C组TM也表达下降，TM mRNA表达也上调，与A组比较有显著统计学意义

8、（P<0.01），与B组比较无统计学意义（P0.05）。D组TM表达上调， TM mRNA表达显著下调恢复至A组水平，与A组比较无统计学意义（P0.05），与B组、C组比较有显著统计学意义（P<0.01）。见表1，图12。   表1  参附注射液对失血性休克大鼠肝组织TM 、TM mRNA表达的影响    3  讨论        血管内皮细胞对于调节凝血、抗凝、纤溶平衡具有重要作用。生理情况下,血管内皮细胞分泌凝血酶调节蛋白等抗凝物质,防止血栓形成。病理状态时,

9、血管内皮胞分泌组织因子、纤溶酶原抑制剂等促凝物质,发挥止血作用。在失血性休克过程中,缺血、缺氧及氧自由基的释放导致血管内皮细胞损伤，组织因子释放入血, 大量凝血酶形成，血小板激活，血细胞大量破坏，引起凝血功能紊乱。凝血酶调节蛋白（TM）是位于血管内皮细胞上的跨膜糖蛋白,对凝血酶激活蛋白C 起重要辅助作用。研究发现, TM 在凝血过程中具有抗凝和促纤溶的单相作用, 是连接凝血与抗凝途径联系的桥梁。TM 与凝血酶有高度亲和力, 当形成凝血酶-TM 后具有使凝血酶的促凝作用、促纤维蛋白形成和血小板活化转变为促蛋白C  活化, 使蛋白C激活率超过正常的1000 倍,并抑制凝血酶激活血小板及内

10、皮细胞的能力。作为蛋白C活化的协同因子, TM 在活化蛋白C的抗凝血和抗炎机制中是必需的，高水平的活化蛋白C 的产生依赖于高水平的凝血酶-TM复合物,相反下调TM 的水平可减少活化蛋白C 的生成。(1)失血性休克肝组织 TM 表达下降、TM mRNA表达显著上调：本实验采用 Western  blotting 法检测失血性休克肝组织TM 蛋白表达，结果表明休克早期引起大鼠肝组织TM 表达下降，可能机制：内皮细胞受损或某些炎症介 质促使TM 从血管内皮细胞脱落入血。TM 成为可溶性TM (s TM ) 片断,丧失其对蛋白C 的活化能力，可溶性TM (s TM ) 片断可作为血管内皮细胞

11、受损的分子标记。蛋白C 持续高速转化成活化蛋白C，引起蛋白C、TM、EPCR消耗增加。休克时内皮细胞功能受损 TM 蛋白合成减少。综上所述，内皮细胞TM 蛋白水平降低。其降低导致蛋白C激活受损, 提示失血性休克活化蛋白C生成减少，减弱活化蛋白C抗凝溶栓、抗炎、调控内皮细胞的作用，促进休克的发展。本实验还发现失血性休克引起肝组织 TM mRNA表达水平上调。李银平等对脓毒症大鼠用血必净注射液早期干预实验中发现， TM、EPCR 的mRNA 在正常大鼠肝、肺两个重要生命器官组织中均有一定量表达, 其中肝组织表达比肺组织要强; 盲肠结扎穿孔术后8 48h， 肝、肺组织TM 和EPCR 的mRNA 表

12、达均有不同程度的增强, 至伤后72 h 基本恢复到术前水平。炎症介质肿瘤坏死因子-(TNF-)、内毒素等可下调内皮细胞TM mRNA的表达, 而凝血酶则可上调TM mRNA 转录。失血性休克时大量内皮细胞受损，组织因子入血，血小板被激活，血细胞大量破坏，大量凝血酶形成。凝血酶上调TM mRNA转录水平。   失血性休克肝组织内皮细胞 TM 蛋白水平下降与转录水平的mRNA表达上调，两者变化趋势不一致。原因可能是组织中 mRNA 表达和蛋白表达本身是不尽相同的；另外可能是蛋白表达具有时效性，同一时间的mRNA 水平不代表当时的蛋白水平；其次，蛋白质合成和分解速度不同；再次，组

13、织中可能存在 TM mRNA转录，但内皮细胞受损蛋白质翻译减少或缺如。临床表明DIC 患者的蛋白S 水平下降，TNF 可通过降解作用使TM 的半衰期缩短,并使TM的mRNA 转录受到抑制。综合以上,蛋白质消耗增多，降解增多或翻译减少均可导致组织中 TM 蛋白水平下降。(2)林格液复苏组对肝组织 TM 及TM mRNA表达：改变不明显，本实验C组大鼠肝组织 TM 表达下降，TM mRNA 升高，与A组比较有显著统计学意义，与休克组比较无统计学意义。提示林格液复苏在失血性休克中对蛋白C激活系统表达无明显调节作用。(3)D组恢复肝组织 TM 及TM mRNA表达水平：参附注射液源自参附汤，由人参30

14、g、附子15g组成。中医认为其具“益气温阳固脱”之功，主治厥脱及阳虚诸证。现代临床用于心力衰竭、休克等证，属心肾阳虚，阳气欲脱，脉细欲绝，病势危急而见上证者。临床研究表明参附注射液能改善患者的血压、尿量、血气及微循环，在失血性休克的抢救中起重要作用。    本实验参附复苏组与林格液复苏组比较，肝组织TM 表达显著上调，TM mRNA表达显著下调恢复至A组水平，与休克组、林格液复苏组比较有显著统计学意义。这表明可能是参附注射液通过降低结合型 TM 的损伤, 并减少可溶性 TM 的产生,使内皮细胞抗凝和纤溶活性增加。    对败血性休克大

15、鼠心肌损伤的保护作用发现参附能减少血管间粘附分子-1(ICAM-1)、TNF-等炎症因子的表达9，防止过度炎性反应和免疫抑制,使内皮细胞损伤减轻。夏中元等10在失血性休克兔模型实验显示参附治疗组肠黏膜NO、丙二醛(MDA) 及Ca2+ 含量无明显增加, 乙状结肠黏膜内pH显著升高，增加肠黏膜灌注及氧合、抑制NO的产生及抗炎效应、清除氧自由基及减轻钙超载。发挥保护肠黏膜内皮细胞作用。失血性休克细胞凋亡增加，参附注射液能抑制Caspase-3表达，同时上调Bcl-2，抑制细胞凋亡11。用参附注射液10 ml/kg 治疗大鼠肝缺血再灌注，发现肝实质细胞和肝窦内皮细胞损伤明显减轻，肝窦形态的改变和肝窦

16、内的瘀血、白细胞聚集也明显减轻；提示参附注射液通过保护肝窦内皮细胞，降低TXA2 /PGI2 比值及减轻肝窦内炎性反应，改善肝脏微循环灌注12。    综上所述参附注射液能减少内皮细胞损伤。本实验表明参附通过降低结合型 TM 的损伤, 并减少可溶性 TM 的产生，达到PC系统良好的整合, 逆转凝血酶的活性,增加活化蛋白C的抗凝溶栓、抗炎、调控内皮细胞的作用，从而抑制休克早期组织 TM mRNA 表达反应性上调。本实验结果具有一定的临床意义，为祖国传统中药参附注射液在治疗休克的临床应用提供更多理论依据，值得进一步深入研究。【参考文献】  1 Rivers

17、EP. Early and innovative interventions for severe sepsis and septic shock: taking advantage of a window of opportunity. C MAJ， 2005，173(9): 10541065.2 Sharma P，Walsh KT，Kerr-Knott KA，et al. Pyruvate modulates hepatic mitochondrialfunctions and reduces apoptosis indicators during hemorrhagic shock in

18、 rats.Anesthesiology， 2005，103(1):6573.3 Xu J , Esmon N L , Esmon C T. Reconstitution of the human endothelial cell protein C receptor with thrombomodulin in phosphatidylcholine vesicles enhances protein C activation. J Bio l Chem, 1999, 274 (10): 67046710.4 Weiler H, Lindner V, Kerlin B, et al. Characterization of a mouse model for thrombomodulin deficiency. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2001, 21 (9): 15311537.5 Chao TH, L i YH, TsaiWC, et al. Elevation of the soluble thrombomodulin levels is associated with inflammation after percutaneous coronar