活血健脾补肾法对MSC移植在结肠炎大鼠肠道增殖分化的影响

1、活血健脾补肾法对MSC移植在结肠炎大鼠肠道增殖分化的影响    2.湖北中医药大学,湖北 武汉430061) 摘 要:目的:探讨中医活血健脾补肾法对骨髓间充质干细胞(MSC)移植在结肠炎大鼠肠道增殖分化的影响。方法:雌性SD大鼠以5%2、4、6,三硝基苯磺酸(TNBs)诱导形成结肠炎模型,造模后随机分为模型对照组、MSC移植组、活血组、健脾组、补肾组,第2天将体外分离培养的雄性SD大鼠MSC经尾静脉注射到各组雌性大鼠体内。疗程结束后,取大鼠结肠组织,免疫组化法检测其肠道干细胞标记物Musashi-1、端粒酶逆转录酶(TERT)的表达。结果:免疫组化检测到

2、MSC移植组及中药治疗各组大鼠结肠黏膜组织Musashi-1及TERT均有阳性表达,其中活血组与MSC移植组比较差异有显著性意义。结论: 活血法代表方药桃红四物汤较明显促进MSC在结肠炎大鼠肠道增殖分化。 关键词:溃疡性结肠炎;骨髓间充质干细胞;移植;中医药疗法?Effect of Promoting Blood Flow,Invigorating Spleen or Invigorating Kidney Recipe on Proliferation and Differentiation of MSC in the Colon of Ulcerative Colitis After Tr

3、ansplantation ZHANG Yong?feng1,YANG Jin2,WU Zheng?zhi1,ZHANG Li1,HU Yin?qing1,YANG Min1 (1.Shenzhen Clinical Institute of Integrated TCM and Western Medicine,Shenzhen Second Peoples Hospital, Shenzhen 518035,Guangdong,China;2.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China)? Abst

4、ract:Objective:To explore the Effect of promoting blood flow,invigorating spleen or invigorating kidney recipe on proliferation and differentiation of Bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) in the Colon of Ulcerative Colitis(UC) after transplantation. Methods:SD female rats were randomly into the m

5、odel group,the MSC transplantation group,promoting blood fiow group,invigorating the spleen group and invigorating the kidney group after the colitis model were induced by Trinitrobenzene sulphonic acid,(TNBs).The MSC from SD male rats were purified by culture expansion in vitro and then were transp

6、lanted into SD female rat madels of UC through caudal vein next day.The expression of Musashi-1、TERT in colon tissue after the treatment was examined by immunohistochemistry.Results:The expression of Gastrointestinal stem cells markers such as Musashi-1 and TERT was positive, promoting blood flow gr

7、oup is significantly increased(PKey words:uicerative colitis;bone marrow mesenchymal stem cell;transplantation;traditional Chinese medicine therapy 收稿日期:2009-11-17 基金项目:深圳市科技计划资助项目(200802028) 作者简介:张永锋(1965-),男,广东揭西人,主任医师,硕士研究生导师,博士,主要从事中西医结合脾胃病的研究。 肠道黏膜甚至黏膜下肌层的结构和功能受到破坏,通过干细胞技术和组织工程技术定向诱导干细胞使其分化为特定的

8、细胞以替代功能障碍的细胞或组织缺损,这可能是治疗肠道疾病的根本方法,干细胞将成为细胞疗法修复胃肠黏膜损伤过程中应用最多的靶细胞1。根据中医理论及现代研究成果,综观UC(缓解期)临床治疗的有关方药,其治法基本属于活血、健脾、补肾范畴,本文采用细胞、分子生物学技术和方法,比较中医药基本治法(活血、健脾、补肾)代表方药(分别为桃红四物汤、参苓白术散、金匮肾气丸)对骨髓间充质干细胞(MSC)移植在结肠炎大鼠肠道增殖分化的影响,筛选中医药有效治法。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物SPF级雌性SD大鼠,120只,SPF级雄性SD大鼠,20只,6周龄,体重(200±20)g,由广东

9、省医学实验动物中心提供,质量合格证号:0037647。 1.1.2药物及试剂桃红四物汤(干地黄15g,川芎8g,白芍10g,当归12g,桃仁6g,红花4g),参苓白术散(莲子肉10g,薏苡仁10g,缩砂仁10g,桔梗10g,白扁豆15g,白茯苓20g,生晒参20g,甘草20g,白术20g,山药20g。),金匮肾气丸(干地黄24g,山药12g,山茱萸12g,泽泻9g,茯苓9g,牡丹皮9g,桂枝3g,附子3g)由深圳市第二人民医院门诊部中药房提供。按比例将原方药物置于搪瓷药罐中,以110加入蒸馏水浸泡2h,加热煮沸30min,滤出头煎,药渣加蒸馏水适量,再煮沸30min,滤出二煎,合并2次滤液,浓

10、缩成200%置冰箱。鼠抗兔Musashi-1单克隆抗体购自上海生物工程公司,鼠抗兔TERT多克隆抗体、SP试剂盒和DAB染色剂购自武汉博士德生物技术有限公司,10%中性甲醛,链霉亲和素-生物素-过氧化物酶免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司),5% 2、4、6-三硝基苯磺酸(TNBs)购自Sigma公司。 1.2方法 1.2.1动物造模方法2大鼠造模前禁食不禁水48h,禁食24h后提起鼠尾将其悬空,使挣扎以排出大肠远端的大便,共2次,每次相隔6h以上,排空大便后以氯氨酮(100mg/kg)一次性腹腔注射麻醉大鼠,用外径为2mm的硅胶管插入大鼠肛内约8cm,经管内注入5% 2、4、6-TNBs水溶

11、液0.4mL(100mg/kg)加入50%乙醇0.25mL,约10s灌注完毕。        1.2.2动物分组与给药 SPF级SD雌性大鼠,造模第二天后随机分为模型对照组、MSC移植组、活血组、健脾组、补肾组,每组20只。将大鼠鼠尾常规用碘伏消毒,再用酒精去碘,用1mL注射器将约含2×106个雄性SD大鼠MSC的悬浮液3约0.4mL经鼠尾静脉注射于MSC移植组、活血组、健脾组及补肾组各只大鼠体内。按照实验动物及人体表面积比例换算,活血组大鼠桃红四物汤剂量为12g/kg、健脾组大鼠参苓白术散剂量为30g/

12、kg、补肾组大鼠金匮肾气丸药物剂量为16g/kg,其他各组大鼠给予生理盐水2mL/只,灌胃给药,均为每日1次,连续15日。 1.2.3标本采集与处理 各组动物灌胃结束后,禁食不禁水24h后脱颈椎法处死动物,迅速剖腹,剖取距肛门210cm处结肠共8cm,沿肠系膜缘剪开肠腔,用冰生理盐水冲洗肠内容物,冲洗干净后,用无菌滤纸迅速拭干,将结肠组织以4%多聚甲醛固定,常规石腊包埋、切片待检。 1.2.4大鼠结肠组织Musashi-1 TERT的检测 免疫组化SABC法,按试剂盒说明书进行操作,石蜡切片脱蜡,水洗;3%过氧化氢室温孵育10min;滴加一抗,室温孵育60min;滴加二抗,室温孵育10min;

13、滴加DAB溶液,镜检;苏木素复染;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。 1.3统计学处理方法? 所有数据经SPSS 13.0统计软件处理,各组资料用?±s?表示,采用非参数统计方法Wilcoxon秩和检验比较各组资料间的差异,?P?2结 果 2.1判断标准 ? 采用半定量积分法计算染色积分4-5,即分别对每张切片的阳性细胞数及阳性细胞着色程度进行分级记分,结果以两项之和表示。阳性细胞率:每张切片检测5个视野(×400),所见的阳性细胞分为04级(共5级):0级为阴性,记0分;1级阳性细胞占1%25%,记1分;2级阳性细胞占26%50%,记2分;3级阳性细胞占51%75%

14、,记3分;4级阳性细胞占76%100%,记4分。染色强度:显微镜下观察,仅细胞核着蓝色者为阴性,细胞浆或核膜上呈棕黄色为阳性;强度分03级(共4级):0级为阴性,记0分;1级为弱阳性染色,记1分;2级为阳性染色,记2分;3级为强阳性染色,记3分。 2.2 各组大鼠结肠组织Musashi-1 TERT染色积分值? 见表1。 表1各组大鼠结肠组织Musashi-1 TERT染色积分值(±s) 组别nMusashi-1TERT 模型对照组200.49±0.310.38±0.27 MSC移植组201.53±0.511.12±0.62 活血组203.31

15、±0.54*2.95±0.62* 健脾组202.29±0.742.21±0.83 补肾组202.13±0.491.89±0.57 注:与MSC移植组比较,*P实验结果表明MSC移植组及中药治疗各组大鼠结肠黏膜组织Musashi-1及TERT均有阳性表达,其中活血组与MSC移植组比较差异有显著性意义,活血法代表方药桃红四物汤对MSC在UC大鼠结肠的增殖分化有明显促进作用。 3讨 论? 正常情况下,结肠黏膜上皮是机体更新和修复较快的组织,结肠黏膜的再生和修复依赖于结肠黏膜干细胞,结肠黏膜干细胞位于结肠隐窝的底部,数量极少,可分化为成熟的结

16、肠黏膜细胞,维持结肠黏膜的生理更新6。UC最典型的病理特点是大量隐窝坏死,形成脓肿,而结肠黏膜干细胞位于隐窝基底部,隐窝坏死导致原本极少的结肠黏膜干细胞进一步减少,无法再生和分化成为足够的结肠黏膜上皮细胞以修复损伤的黏膜7-8。因此,需大幅提高循环中的干细胞数量,以便随血循环到达病变结肠,在结肠微环境中,受诱导进行增殖和转分化为结肠黏膜干细胞和结肠黏膜上皮细胞,增强机体对病损黏膜的修复能力,促进溃疡愈合,恢复其正常的生理功能。? 随着对干细胞鉴别和分离的研究进展,已有结果表明9:Musashi-1及TERT可作为肠道干细胞的标记物。Musashi-1是一种进化保守的RNA结合蛋白,研究表明mu

17、sashi-l也是肠道干细胞的选择性标记。Kayahara等描述了在小鼠小肠的musashi-l阳性细胞10;Nishimura等11也描述了其在结肠细胞中的表达情况。研究发现放射损伤后小鼠肠道标本的musashi-1明显增加;应用免疫组织化学在新生的小鼠肠道、成熟的小鼠肠道和再生肠道的隐窝中均检测到它的表达,与预言的干细胞区域相一致。端粒酶逆转录酶 (telomerase reverse transcriptase,TERT )是人类端粒酶的主要组成部分,是端粒酶活性的重要限速因子12。端粒酶系统在细胞的增殖、生长和衰亡过程中发挥重要作用,正常人体细胞除了生殖细胞、淋巴细胞、肠道干细胞外,几

18、乎检测不到端粒酶的活性或活性很低。? 本实验表明:MSC移植于结肠炎大鼠后,随血循环到达结肠定植,中医活血、健脾、补肾法中药对其有一定的促进作用,其中活血法代表方药桃红四物汤较明显促进MSC在结肠炎大鼠肠道增殖分化;实验结果揭示了UC治疗的新思路。 参考文献 1 胡建昆,陈心足,周总光.干细胞与组织工程在肠道的研究进展J.中国修复重建外科杂志,2007,21(2):175-179. 2 张涛,谢建群.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究J.中国中西医结合消化杂志,2006,14(4):240-242. 3 杨晋,李映红,张永锋,等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定J.深圳中西医结合杂志,2008

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