毕业论文-散尾葵叶枯病病原研究

1、散尾葵叶枯病病原菌鉴定和生物学特性研究海 南 大 学毕 业 论 文（设计）题 目：散尾葵叶枯病病原鉴定及其生物 学特性 学 号： B0711019 姓 名： 李 龙 年 级： 07制药工程（农药方向） 学 院： 环境与植物保护学院 系 别： 制药工程系 专 业： 制药工程（农药方向） 指导教师： 张荣意 教授 完成日期： 2010年 11 月 5 日 摘 要散尾葵（Chrysalidocarpuslutescens H.Wendl）叶枯病是散尾葵上的一种重要病害，该病严重影响了散尾葵的生长发育及其观赏价值。目前，国内对该病的防治报道较多，但还未查到对其病原物相关研究的报道，为了进一步做好防治工

2、作，本文对该病害病原的鉴定及生物学特性进行了基础性研究。散尾葵叶枯病病原主要危害散尾葵叶部，尤其是幼嫩叶尖，轻者使整片叶片干枯，重者会导致植株整株死亡。通过试验及相关资料显示，该病原菌为真菌门半知菌类，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，帚梗柱孢属，帚梗柱枝菌（Cylindrocladium quinqueseptatu Figueredo）。该属真菌常引起植物焦枯病害（如桉树焦枯病Eucaly puts dicback）和根、茎腐败病（如水稻叶鞘腐败病Rice sheath rot）等，对种植农业、园艺行业等有较大影响。关键词：散尾葵；叶枯病；鉴定；生物学特性AbstractChrysalidoca

3、rpus lutescens （Chrysalidocarpuslutescens H.Wendl）leaf blight is an important disease on the Chrysalidocarpus lutescens, Chrysalidocarpus lutescens the disease has seriously affected the growth and development and ornamental value. At present, there is no report on the prevention and treatment of di

4、sease, but has not yet found its coverage of pathogen research, in order to further improve relevant prevention and control work, this pathogen in the disease and the biological characteristics of the basic research .Chrysalidocarpus lutescens leaf blight pathogen primarily affecting San Chrysalidoc

5、arpus lutescens leaves, especially the young tip,the light so that the entire piece dry leaves, weight of whole plant could cause death. By testing and related information, the pathogen fungus is Fungi Imperfect, Hyphomycetes, Moniliales, moniliaceae, Cylindrocladium，Cylindrocladium quinqueseptatu F

6、igueredo . The fungi cause plant scorch diseases and more (such as Eucaly puts dicback) and the root and stem rot disease (such as Rice sheath rot) and so on for agricultural, horticultural industries have a greater impact. Keywords Chrysalidocarpus lutescens； leaf blight；Identification； Biological

7、characteristics；目 录1 材料与方法 41.1 材料来源 41.2 病原菌的分离及菌种的纯化 41.3 分离菌株致病性测定 5 1.4 生物学特性测定 51.4.1 不同温度对菌丝生长的影响 51.4.2 不同光照对菌丝生长的影响 51.4.3 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 51.4.4 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 61.4.5 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 61.4.6 病原菌菌丝致死温度测定 61.4.7 病原菌产孢诱导及病原菌鉴定 62 结果与分析 72.1 症状描述 72.2 病原菌致病性测定 82.3 不同温度对菌丝生长的影响 92.4 不同光照对菌丝生长影

8、响 102.5 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 102.6 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 112.7 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 122.8 病原菌菌丝致死温度测定 142.9病原菌产孢诱导及病原菌鉴定 143 结论与讨论 15致谢 17参考文献 18散尾葵叶枯病病原菌鉴定及其生物学特性散尾葵（Chrysalidocarpus lutescens H.Wendl），又名黄椰子，为丛生常绿灌木或小乔木，棕榈科 Palmaceae，散尾葵属 Chrysalidocarpus H. Wendl.植物1。散尾葵原产非洲的马达加斯加岛，世界各热带地区多有栽培，我国引种栽培广泛，常栽种于草地、树荫

9、、宅旁，也用于盆栽，是布置客厅、餐厅、会议室、家庭居室、书房、卧室或阳台的高档盆栽观叶植物。散尾葵易发生叶枯病、根腐病和介壳虫类危害等，尤以叶枯病为害较重。散尾葵叶枯病是一种常见病害，其植株发病率高达36%，其中病株单株叶片发病率平均约为23%，对散尾葵生长影响很大，轻者使叶片干枯，重者会导致植株整株死亡。病菌最先侵染叶尖和叶缘，发病初期染病处呈褐色斑点或条块状斑块，中期斑点或斑块逐渐扩大并相互连接，后期叶片呈现灰白状干枯，严重影响到了散尾葵的观赏性2。为了更深入地了解该病害病原菌及其病害特点，笔者对该病害病原进行了鉴定及其生物学特性的测定。 1 材料与方法1.1 材料来源散尾葵病叶于2009

10、年10月采自儋州两院。1.2 病原菌的分离及菌种的纯化采用常规组织分离法34分离病原菌。采集田间自然发病典型的散尾葵叶片，剪取病健交界处组织，大小约为5mm×5mm；用70%乙醇消毒10s，0.1%HgCl2(g/V)表面消毒30s；灭菌水冲洗34次，无菌操作接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）5上，培养34d。在平板上标记上面PDA长出的不同类型的菌落，编号1号、2号，无菌操作分别将1号、2号菌种接种到PDA平板上，培养45d。采用单菌丝分离纯化（由于未观察到孢子，所以选择使用菌丝段纯化）4，用分别用灭菌水将1号、2号菌株配置成菌丝悬浮液（注意打散菌丝，使菌丝成为单个菌丝段，不互

11、相缠绕），用接种环取1环菌丝悬浮液与10mL已融化的PDA培养基（约40）充分混合，倒入灭菌的培养皿中，置于28恒温培养箱中培养。2d后，从培养皿中挑取单个分散的菌落移植到PDA培养基上进行纯化培养，然后转入PDA试管斜面保存5。1.3 分离菌株致病性测定根据柯赫氏法则6进行寄主活体接种测定。在田间选取健康的散尾葵叶片18片，用无菌水清洗叶片表面，在每其中9片叶面用消毒过的针轻轻刺伤叶片表皮，将纯培养在PDA上的1号、2号菌打菌饼（菌饼大小约为3mm）然后接种到叶片的伤口处，以无菌的PDA培养基块做对照并进行分组为A（1号）、B（2号）、C（CK），每组三个重复，剩余9片叶片按上述方法进行无伤

12、接种处理（不刺伤叶片表皮），分别依次编号为D（1号）、E（2号）、F(CK)，保温保湿，5d后观察。如果该病原菌能使散尾葵发病，并与田间自然发病症状相比较，若存在相同症状则将长出的病斑采用1.2所述方法分离得到病原菌，并将两次获得的病原菌作比较，判断两次提取的病原菌是否相同，以确定该菌为致病菌。1.4 生物学特性测定1.4.1 不同温度对菌丝生长的影响在无菌操作条件下，将直径5mm菌龄相同的菌饼移到PDA培养基平板中央，分别置于15、20、25、28、30和37的恒温培养箱中培养，观察菌丝生长情况，每天测量菌落直径，比较在不同温度下菌丝生长速率。5d后用十字交叉法测量菌落直径。每处理三个重复。

13、1.4.2 不同光照对菌丝生长的影响将直径为5mm的菌龄相同（培养4d）的菌饼接种到PDA培养基平板中央，分别置于24h完全光照，12小时光照和黑暗交替，24小时完全黑暗3中环境中，在28恒温培养箱中培养，6d后测量菌落直径。每处理三个重复。1.4.3 不同pH值对菌丝生长的影响制作PDA培养基，用0.1mol/L的HCl和NaOH将其pH值分别调节到4、5、6、7、8、9、10这7个梯度，湿热灭菌（121,20min），再用无菌的0.1mol/L的HCl和NaOH重新调节pH值后倒入已灭菌的培养皿中制成平板7；用直径为5mm的打孔器，取菌落边缘的菌饼（在PDA平板上培养4d），接种到不同pH

14、值的培养基平板中央，置于28恒温培养箱中培养，6d后观察菌落状况。每处理值三个重复。1.4.4 不同碳源对菌丝生长的影响使用Czapek固体培养基8为基础培养基：MgSO4·7H2O 0.5g, KH2PO4 1g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，NaNO3 2g(纯氮约0.3294g)，琼脂 20g，蒸馏水定容至1000mL。另外，分别以等当量的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖作为碳源（以20g葡萄糖含碳量为标准），配置成不同碳源7的培养基，湿热灭菌（121，20min），然后制成平板，在平板中央接入直径为5mm菌龄相同的菌饼

15、；置于28恒温培养箱中培养，5d后观察菌落状况。每处理三个重复。1.4.5 不同氮源对菌丝生长的影响使用Czapek固体培养基为基础培养基：MgSO4·7H2O 0.5g, KH2PO4 1g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水定容至1000mL。另外，分别以等当量硝铵酸2.00g、硫氨酸1.53g、色氨酸2.40g、肌氨酸1.00g、蛋白胨4.00g、L-苯丙氨酸4.00g、磷酸二氢铵2.70g为氮源，配置成不同氮源的培养基，湿热灭菌（121,20min），然后制成平板，在平板中央接入直径为5mm菌龄相同的菌饼；置于2

16、8恒温培养箱中培养，5d后观察菌落状况。每处理三个重复。1.4.6菌丝致死温度测定将病原菌菌饼（5mm）移入已灭菌的试管内，塞上橡皮塞，分别45、50、55、60、65和70恒温水浴处理10min，然后再分别接种到PDA培养基平板中央，以未处理菌饼接种到PDA培养基平板中央为对照，28恒温培养箱中培养，5d后观察菌落状况。每处理三个重复。1.4.7 病原菌产孢诱导及病原菌鉴定由于未在培养基上获得病原菌孢子，设计了以下促使孢子产生的方法（表1）；观察菌落及分生孢子颜色、形态、以及分生孢子梗形态并测量孢子大小。表1 促使孢子产生的方法培养基处理方式散尾葵葡糖糖琼脂培养基28恒温培养箱中培养8d。散

17、尾葵琼脂培养基28恒温培养箱中培养8d。燕麦片琼脂培养基28恒温培养箱中培养8d。马铃薯琼脂培养基28恒温培养箱中培养8d。散尾葵叶组织PDA培养基28恒温培养箱中培养8d。散尾葵植株活体嫩叶保温保湿直到叶病部灰白干枯，长出小黑点PDA28正常培养4d，紫外灯（200275nm）照射20min，28恒温培养4d。PDA28正常培养4d， 12小时光暗交替，28恒温培养4d。PDA28，正常培养5d后，将培养皿置于5低温条件下2天，再转入28恒温培养3d。PDA28正常培养5d后，将菌丝挑出接种于无菌蒸馏水上，28恒温培养5d。注：1、散尾葵葡糖糖琼脂培养基配制营养为：新鲜散尾葵叶组织20g，葡

18、糖糖2g，琼脂2g，蒸馏水100mL。2、散尾葵叶组织PDA培养基制作方法：将新鲜健康的散尾葵叶片表面消毒，剪成小块（约3mm×3mm）散置于PDA培养基平板上。2 结果与分析2.1 症状描述该病原菌主要危害叶部，尤其是上部嫩叶。病菌最先侵染叶尖和叶缘，发病初期染病处呈褐色斑点或条块状斑块，中期斑点或斑块逐渐扩大并相互连接，渐扩展为条斑，并可汇合成不规则的坏死块，后期叶片呈现灰白状干枯，边缘有深色线条围绕；温湿条件下病部散生一些小黑点，轻者使叶片干枯，重者会导致植株整株死亡。（如图1AD）2.2 分离菌株致病性测定用田间自然发病的散尾葵病株分离获得纯菌种，按照柯赫氏法则进行接种，结果

19、表明：刺伤接种A处理组3d后病原菌接种部位开始发病，出现水渍状小斑点，5d后染病处呈褐色斑点或条块状斑块，约10d后斑点或斑块逐渐扩大并相互连接，渐扩展为条斑，并可汇合成不规则的坏死块，最后叶片呈现灰白状干枯，边缘有深色线条围绕，温湿条件下病部散生一些小黑点，其发病率达100%；B处理组和C无发病现象。无伤接种D处理组5d后病原菌接种部位开始发病，其发病过程与刺伤接种A处理大体相似，发病率为66%，无伤接种E、F处理组无发病现象。用获得的菌种接种后出现的症状与田间自然发病症状相同，从接种发病的植株分离获得的病原菌与田间自然发病获得的病原菌相同；对照植株生长良好，同样进行组织分离，无病原菌存在，

20、证实分离菌是散尾葵叶枯病的致病菌。A： 叶尖易受害；B：渐扩展为条斑，并可汇合成不规则的坏死块；C：病斑中心灰白色，边缘有深色线条围绕；D：叶片有一半以上干枯卷缩图1 散尾葵叶枯病发病症状 图2 病原菌在PDA上的菌落 图3 光照对病原菌菌丝生长的影响2.3 不同温度对菌丝生长的影响结果表明：病原菌在2037均能生长；温度在1528，菌落直径随着温度的升高而逐渐增加；温度在2837范围内，菌落直径随着温度的升高而逐渐减小。试验中最适宜菌丝生长的温度为28，培养5d菌落平均直径达到41.5mm；15条件下菌丝生长受阻止或不能生长。所以菌丝生长的最适温度范围在2530，而菌丝能否生长的低温临界温度

21、在为1520之间。（表2）表2 温度对菌丝生长的影响温度Temperature菌落直径（5d/mm）Diameter of colony（5d/mm）菌落特征（5d）Colony character（5d）150.0aA菌丝不生长，未有任何菌丝特征2026.1bB菌落圆形、边缘较整齐、浅褐色、棉絮状，边缘菌丝稀疏，未产孢。2535.0cC菌落圆形、边缘较整齐、褐色，菌丝生长旺盛，棉絮状，菌落平整，背面有褐色色素，未产孢。2841.5dD菌落圆形、边缘较整齐、红褐色，菌丝生长旺盛，棉絮状，菌落平整，背面有黑褐色色素，未产孢3030.3eB菌落圆形、边缘较整齐、褐色，菌丝生长旺盛，棉絮状，菌落平整

22、，背面有深褐色色素，未产孢。3711.0fF菌落不规则形、灰白至浅褐色，菌丝稀疏，棉絮状，未产孢。注：差异显著性使用LSR法计算，小写字母代表=0.05水平差异显著性；大写字母代表=0.01水平差异显著性。2.4 不同光照对菌丝生长影响不同光照下，菌丝生长有所不同（图3），从菌丝生长速率和菌丝颜色上来看：24h光照处理组的菌落直径最大，其次是12h光暗交替处理组，24h黑暗处理组的菌落直径相对较小；24h光照处理组的菌落深褐色、表面有大量白色菌丝，12h光暗交替处理组菌落深褐色、表面有少量白色菌丝，24h黑暗处理组菌落深黄褐色。（表3）表3光照对菌丝生长影响处理菌落直径（6d/mm）菌落特征（

23、6d）24h全光照57.3aA菌落较规则圆形、深红褐色，表面有大量白色菌丝，周围菌丝灰白色，未产孢。12h光暗交替53.5bB菌落不规则形、深红褐色，表面有少量白色菌丝，周围菌丝灰白色，未产孢。24h全黑暗52.0bB菌落不规则形、深黄褐色，周围菌丝灰白色，未产孢。注：差异显著性使用LSR法计算，小写字母代表=0.05水平差异显著性；大写字母代表=0.01水平差异显著性。2.5 不同pH值对菌丝生长的影响试验结果表明：pH值在410的范围内，菌丝均能良好生长，除pH=4处理组外，其他组生长速率没有显著差异，但各pH值对菌丝疏密程度及颜色有明显影响。其中，pH=6、7、8三处理组无显著差异但对p

24、H=4处理组生长速率有极显著差异，pH=5、9处理组对pH=4处理组生长速率有显著差异，所以菌丝生长最适pH值是在pH=68。（表4）表4 pH值对病原菌菌丝生长的影响pH值菌落直径（6d/mm）菌落特征（6d）443.7aA菌落形状规则、边缘整齐，菌丝较密、较长、浅红褐色，未产孢。551.0bAB菌落形状规则、边缘整齐，菌丝较密、较长、红褐色略带紫色，未产孢。655.0bB菌落形状规则、边缘整齐、中部隆起，菌丝较密、较长、红褐色，未产孢。753.3bB菌落形状规则、边缘整齐、中部隆起，菌丝较密、较长、红褐色，未产孢。855.3bB菌落形状规则、边缘整齐、中部隆起，菌丝较密、较长、浅褐色，未产

25、孢。950.7bAB菌落形状规则、边缘整齐，菌丝较密、较长、浅褐至灰白色，未产孢。1048.3abAB菌落形状规则、边缘整齐，菌丝较密、较长、灰白色，未产孢。注：差异显著性使用LSR法计算，小写字母代表=0.05水平差异显著性；大写字母代表=0.01水平差异显著性。2.6 不同碳源对菌丝生长的影响从菌落5d生长直径来看(图4)，在供试的含有不同碳源的Czapek固体培养基上，该菌在只含有葡萄糖或麦芽糖做碳源的培养基中生长状况最好，显著优于在只含有乳糖、蔗糖、D-果糖、D-甘露糖或D-木糖的培养基上的生长状况，而在只含有D-甘露糖做碳源的培养基上生长状况最差，显著差于在只含有其他六种糖类培养基上

26、的生长状况。（表5）表5 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响碳源菌落直径（5d）菌落特征（5d）葡萄糖29.3aA菌丝致密，红褐色，平铺，菌落不规则形，底部黑褐色，周围菌丝灰白色，未产孢。乳糖25.7bAB菌丝疏松，浅褐色，平铺，菌落圆形，周围辐射状菌丝灰白色，未产孢。麦芽糖29.7aA菌丝致密，浅褐色至褐色，平铺，菌落不规则形，底部褐色，周围菌丝灰白色，未产孢。蔗糖23.0bB菌丝致密，红褐色，平铺，菌落不规则形，底部黑褐色，周围菌丝致密、灰白色，未产孢。D-果糖23.0bB菌丝致密，浅褐色至褐色，平铺，菌落近圆形形，底部褐色，周围菌丝灰白色，未产孢。D-甘露糖18.7cCB菌丝致密，褐色，平铺

27、，菌落近圆形，底部褐色，周围菌丝灰白色，未产孢。D-木糖23.0bB菌丝致密，褐色，平铺，菌落近圆形，底部褐色，周围菌丝灰白色，未产孢。注：差异显著性使用LSR法计算，小写字母代表=0.05水平差异显著性；大写字母代表=0.01水平差异显著性。图4 不同氮源的对病原菌菌丝生长的影响2.7 不同氮源对菌丝生长的影响从图5可以看出，在供试的含不同氮源的Czapek固体培养基上，该菌在只含有肌氨酸做氮源的培养基上菌丝生长状况最好，极显著优于在只含有其它六种氮源的培养基上的生长状况；在只含有色氨酸或蛋白胨做氮源的培养基上菌丝生长状况较好，极显著优于只含有硝铵酸、磷酸二氢钾、L-苯丙氨酸或磷酸二氢铵的培

28、养基上的生长状况。（表6）图5 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响表6 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响氮源菌落直径（5d）菌落特征（5d）硝酸铵24.7aA菌丝致密，浅褐色，平铺，菌落圆形，底部褐色，周围整齐、菌丝灰白色，未产孢。硫酸铵22.3aA菌丝致密，浅褐色，平铺，菌落圆形，底部褐色，周围整齐、菌丝灰白色，未产孢。色氨酸35.7bB菌丝致密，褐色，平铺，菌落圆形，底部褐色，周围整齐、菌丝灰白色，未产孢。肌氨酸45.7cC菌丝较疏松，褐色至黄褐色，平铺，菌落圆形，底部褐色，周围菌丝辐射状、黄褐色，未产孢。蛋白胨36.0bB菌丝致密，褐色，平铺，菌落圆形，底部褐色，周围整齐、菌丝灰白色，未产孢。

29、L-苯丙氨酸27.7aA菌丝致密，褐色，平铺，菌落圆形，底部褐色，周围整齐、菌丝灰白色，未产孢。磷酸二氢铵28.0aA菌丝致密，褐色，平铺，菌落圆形，底部褐色，周围整齐、菌丝灰白色，未产孢。注：差异显著性使用LSR法计算，小写字母代表=0.05水平差异显著性；大写字母代表=0.01水平差异显著性。2.8 菌丝致死温度测定经过45恒温水浴10min处理的病原菌菌丝生长状态良好，5d菌落平均直径达到41mm，且生长过程及菌落平均直径均与CK组并无明显差异（CK组菌丝1d后开始生长，5d菌落平均直径为42mm）；经过50恒温水浴10min处理的病原菌生长较差，5d菌丝生长直径仅为14mm，约为CK的

30、1/3，且在培养第4d才开始生长，较CK晚两天，说明50恒温水浴10min处理对菌丝生长产生了较大影响；55、60、65和70恒温水浴10min处理组菌丝5d不生长，说明该病原菌菌丝致死温度应该是55。2.9 病原菌产孢诱导及病原菌鉴定 图6 分生孢子梗 图7 细而伸长的分枝端生球形膨大物 图8 分生孢子长圆柱形、3隔4细胞 图9 分生孢子由粘液保持在一起成束病原菌在PDA培养基平板上的菌落形态为：菌丝生长速度为55mm（6d）；菌落形态为较规则圆形、红褐色、边缘为灰白色，较整齐；菌丝生长旺盛，较密、棉絮状、中部稍微隆起，菌落背面有黑褐色色素，菌丝稠密或疏松呈放射状；未产孢。（如图2）诱导产孢

31、显示：病原菌在散尾葵叶组织PDA培养基上能少量产生孢子，在散尾葵植株活体嫩叶接种处的病斑上能刮下大量分生孢子；而其他处理组均未观察到孢子产生。可能原因为：1、该病原菌只能在寄主上通过孢子繁殖；2、当前使用的培养基缺少某些营养元素或者某些营养元素比例不能提供该病原菌产生孢子的条件。在显微镜下观察散尾葵叶枯病病原菌孢子梗及分生孢子的特征是：分生孢子梗直立，无色，规则和重复二叉或三叉分枝(图6)，每端有2到3个小梗，部分有细而伸长的分枝端生球形膨大物（图7）；分生孢子无色至微绿色，长圆柱形（图8），单个着生但通常由粘液保持在一起成束（图9），每个分生孢子3隔4细胞（图8），大小为24.148.5（4

32、2.6）m×2.33.6（3.1）m。结合对病原菌菌落及菌丝的观察结果，通过真菌形态学的比对，鉴定出该病原菌为帚梗柱枝菌（Cylindrocladium quinqueseptatu Figueredo）9。3 结论与讨论该病原菌在PDA固体培养基上菌丝生长状态良好，但未能观察到孢子产生。该病原菌菌丝生长对pH值适应范围广，在pH=410范围均能生长，在pH=68时生长最好；菌丝在2037均能生长，最适温度范围在2530之间，温度低于15菌丝不生长，其致死温度在5055之间。该菌对葡萄糖或麦芽糖的利用率较好，其次是乳糖、蔗糖、D-果糖、D-木糖和D-甘露糖；其对肌氨酸的利用率明显优于色氨酸、蛋白胨、硝铵酸、磷酸二氢钾、L-苯丙氨酸和磷酸二氢铵。通过试验及相关资料显示，该病原菌为真菌门半知菌类，丝孢纲，丝孢目，丝孢科，帚梗柱孢属中的帚梗柱枝菌(Hughes-Tubaki-Barron分类系统)101112。该属真菌还常引起水稻叶鞘腐败病（Rice sheath rot）等，水稻叶鞘腐败病（Rice sheath ro