恶性肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫

1、恶性肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫功能变化的研究 【摘要】 目的 探讨应用流式细胞术(FCM)检测恶性肿瘤病人外周血淋巴细胞多项免疫指标的变化及该指标对恶性肿瘤免疫治疗前后的临床价值。方法 采用流式细胞术检测50例恶性肿瘤病人和31例健康人的外周血CD3、CD4、CD8等八项免疫指标变化，并且对其中10例病人应用免疫制剂治疗前后对抗原表达的结果进行比较。结果 恶性肿瘤病人免疫功能紊乱：(1)细胞免疫和体液免疫功能低下；(2)活化T淋巴细胞明显增多(P0.01)；(3)接受免疫治疗的病人治疗前后差别有统计学意义(P0.01)。结论 用流式细胞仪检测淋巴细胞抗原为临床观察

2、肿瘤病人的免疫状态提供有效的依据，免疫治疗可激活T淋巴细胞而改善免疫功能。【关键词】 恶性肿瘤；流式细胞仪；淋巴细胞；CD；免疫治疗【Abstract】 Objective To explore the application of flow cytometry for the changes of multiple immune indexes in peripheral blood of malignant tumor patients and the clinic value of the indexes for the immunotherapy of malignant tumor.

3、Methods Flow cytometry was employed for determining eight indexes，including CD3、4、8，et.of 50 malignant tumor patients and 31 healthy persons.Furthermore，the results before and after immunotherapy of 10 patients were compared.Results Immune function of malignant tumor patients is generally disordered

4、.1.Both the cell immunity and the body fluid immunity are low.2.The level of active T lymphocytes are greatly high with the control(P0.01).3.For the ten cases who received immunotherapy，which have statistic difference compared by that before the course(P恶性肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫功能变化的研究 ove immu

5、ne function.【Key words】 flow cytometry； malignant tumor； lymphocyte； cluster of differentiation(CD)； immunotherapy恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关。运用流式细胞术的方法，检测T淋巴细胞表面抗原(CD3、CD4、CD8)，B淋巴细胞表面抗原(CD19、CD20)，NK细胞表面抗原(CD16+56)在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化T、B、NK淋巴细胞的免疫指标(CD3/HLA-DR、CD3/CD25)的变化，探讨淋巴细胞在肿瘤中的表达状况及其意义，并进一步分析恶性肿瘤

6、病人免疫治疗前后的免疫功能改变，以致使我们更深一层认识肿瘤在细胞水平的免疫功能。1 资料与方法1.1 研究对象 2003年8月2004年5月本院肿瘤科病房50例恶性肿瘤病人，均经病理确诊，其中肺癌23例，肝癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例，结肠癌3例，鼻咽癌1例，肾癌2例。男28例，女22例，年龄2965岁，平均57岁。其中10例(肺癌6例，淋巴瘤4例)年龄2953岁，平均41 岁，经免疫增强剂(高聚生4ml静滴，每日1次，共3个月；白介素30万U皮下注射，每周2次，共3个月)治疗一疗程(3个月)后，复查一次。对照组31例为健康体检者，男18例，女13例，年龄3650岁，平均

7、43岁，其中年龄和性别构成比与病人组差异无显著性(P0.05)。1.2 材料与仪器 小鼠抗人单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD19、CD20、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25及同型对照、红细胞裂解液(Optilyse C)均为法国Immunotech公司出品。流式细胞仪(Epics XLMCL)是美国BECKMAN COULTER公司生产。1.3 研究方法 使用直接免疫荧光标记全血溶血法，流式细胞仪测定肿瘤病人外周血淋巴细胞表面抗原表达。1.3.1 淋巴细胞表面标记 取荧光标记单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD

8、3/CD25、CD19、CD20各10l放入试管中，分别加入外周全血100l，室温避光孵育15min。并作同型对照。1.3.2 溶血 加入Optilyse C 500l，混匀，室温避光10min。1.3.3 洗涤 离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml? 欢迎您访问恶性肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫功能变化的研究(2) 煸取馗聪吹?次。1.3.4 重悬 加入1ml PBS，混匀，制成单细胞悬液。1.3.5 检测 上机，每个样品检测5000个以上细胞，用FCM软件分析，计算淋巴细胞中各标记细胞的百分率。最后所有数据应用SPSS进行统计学处理。

9、2 结果对50例恶性肿瘤病人与31例健康体检者进行外周血淋巴细胞表面抗原FCM检测，做统计学分析，结果见表1。对10例肿瘤病人在免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T淋巴细胞抗原的表达进行了FCM测定，发现CD4+、CD3+、CD4/CD8比值、CD3+/CD16+56+、CD3+/HLA-DR+、CD3-/HLA-DR+治疗前均较治疗后有显著性升高(P0.01)，见表2。 注：与对照组相比，* P0.01，* P0.05注：与治疗后相比，*P0.013 讨论肿瘤不是一个简单的疾病过程，肿瘤免疫更是一个复杂的过程。恶性肿瘤病人往往免疫功能状态紊乱和低下，而免疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和

10、预后1。由于肿瘤免疫过程复杂特异蛋白少，或是肿瘤细胞或蛋白样物质掩盖了肿瘤抗原，使目前检查手段和蛋白分离方法尚不能检出肿瘤抗原。而通过实验性动物和对人类恶性肿瘤病人大量研究表明：免疫系统的所有有效应成分均对消除肿瘤细胞、控制肿瘤生长有作用，发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞总量的20%，可分为T、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。通常采用单克隆抗体来分析细胞表面抗原分子，并对其分化群(簇，clusters of differentiation)进行了定义，用CD来描述白细胞表面抗原的不同成分。这样通过对恶性肿瘤病人相应免疫指标(CD分子)的检测，可对恶性肿瘤病人的预后进行判断并指导治疗和观

11、察转归57。3.1 T淋巴细胞及表面抗原(CD4、CD8、CD3)与肿瘤的关系 大量研究工作已证实，宿主对机体内发生的肿瘤组织有自发性抵抗现象，而且以细胞免疫为主8。众所周知，机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的主要功能是调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答，并清除细胞表面抗原或细胞内微生物的效应作用。T淋巴细胞进一步分化为辅助性T淋巴细胞(Th，CD4+/CD3+)和细胞毒性T淋巴细胞(Ts，CD8+/CD3+)，对于抗原刺激的应答，辅助性T淋巴细胞分泌细胞因子。细胞因子可促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞的增殖和分化。McMichael认为9T淋巴细胞作为细胞免疫调节的中心枢纽，Th

12、和Ts细胞之间的平衡是通过CD4+和CD8+细胞之间的百分比表达出来的，其值下降表示免疫状态受抑制。目前研究还发现，CD4+细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起着重要作用18，CD4+细胞数减少可使肿瘤细胞发生免疫逃逸10，11。亦有学者认为机体发生肿瘤时，在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱，表现为局部的CD8+亚群增高或降低，或识别肿瘤抗原上发生障碍，但恶性肿瘤病人的免疫功能直到很晚才发生12。对于大多数肿瘤细胞来说，肿瘤细胞表达CD8+而不是CD4+，CD4+不能辨认肿瘤细胞，而是依赖于抗原提呈细胞，如果相关的肿瘤抗原被巨噬细胞提呈(DC)，则对CD4特异性激活后才分泌淋巴因子激活CTL细胞、巨噬细

13、胞和B细胞，产生其他淋巴因子和淋巴毒素和肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子可溶解肿瘤细胞。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人进行外周血FCM检测，肿瘤组CD3、CD4+/CD3+、CD4/CD8比值明显低于对照组，肿瘤组C D8+/CD3+明显高于对照组，这表明恶性肿瘤病人的细胞免疫明显低下(P0.05或P0.01)。3.2 B淋巴细胞及表面抗原(CD19、CD20)与肿瘤的关系 肿瘤的体液免疫是B细胞及抗体依赖的杀伤作用。B细胞表面免疫球蛋白与肿瘤抗原结合，处理和递呈肿瘤抗原，从而诱导T细胞对肿瘤的应答。B细胞所产生的抗体是多克隆异源性抗体。CD20是一非免疫球蛋白产物，参与细胞激活，是B细

14、胞的特异性标志，前B细胞至活化B细胞时表达这一分子。而CD19作为全B细胞表面标志性抗原，是B细胞活化的共受体13，在B细胞活化后消失，在外周血中正常分布为815。通过对CD19与CD20的检测，可在一定程度上反映出机体体液免疫功能状态14。本文对50例肿瘤病人的CD19、CD20进行检测，其中恶性肿瘤病人组CD19与CD20明显低于健康对照组(P0.01)，表明肿瘤体液免疫也明显受抑制，与文献报道一致15。3.3 NK细胞及表面抗原(CD16、CD56)与肿瘤的关系 NK细胞是正常机体中对肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用的淋巴样细胞，是一种广谱的杀伤细胞，对阻止肿瘤生长起重要作用。NK细胞是不同

15、于T 、B淋巴细胞的淋巴细胞群，它们在体内相对较少，它们来源于骨髓的大颗粒细胞。它们不需预先致敏即能分泌细胞毒因子，从而杀伤肿瘤细胞16 。虽然NK细胞无靶细胞特异性，但在缺乏抗体和ADCC效应时，它们表现几种水平的靶细胞选择性：首先，它们对肿瘤细胞比对大部分正常细胞更具毒性作用；其次，不同的NK细胞克隆对不同来源的肿瘤类群表现不同的细胞毒模式。NK细胞代表了宿主抵抗原发和转移部位肿瘤生长的第一道防线，并通过T细胞补充特异性抗肿瘤应答。在某种意义上说，NK能强烈杀伤肿瘤细胞。有研究表明，体外介导杀伤大多肿瘤细胞的细胞亚群，90以上是激活的NK细胞17，18。NK细胞表面标志主要是CD16和CD

16、56，其中CD16一般表达于未成熟NK细胞表面，CD56于成熟NK细胞表面，二者有交叉。其表达水平与NK细胞的整体活性具有相当的作用，其下降提示机体NK细胞作用受抑制，细胞免疫功能下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞作用2。陆云等认为19CD16或CD56细胞数与NK细胞活性相关性随不同疾病及疾病不同阶段而变化。张峻梅等20认为，肺癌病人NK细胞数与正常对照无显著性差异。本文对50例肿瘤病人和31例健康人的NK细胞即CD3+/CD16+56+进行比较，恶性肿瘤病人NK细胞较对照组显著升高(P0.01)。这并不说明恶性肿瘤病人在细胞免疫和体液免疫降低时，NK细胞数量和活性增加。NK升高只是一种假象，因

17、为测定时T+B+NK的值应在95105之间3，而T、B细胞值均降低，为了维持总淋巴细胞数量的恒定，NK的测定值升高，其实恶性肿瘤病人的 ( 恶性肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫功能变化的研究(4) ) NK细胞活性是降低的。3.4 活化淋巴细胞及表面抗原(CD25、HLA-DR)与肿瘤的关系 静止T淋巴细胞在接受刺激后可发生增殖活化而形成效应细胞，表现为细胞因子的分泌及细胞因子受体和粘附分子在细胞表面表达。T淋巴细胞活化需T细胞受体与相应抗原结合为第一信号，同时又必须辅以第二信号即共刺激分子的结合，而T淋巴细胞的分裂增殖是以细胞因子与IL-受体(IL-2R)的结合为启动

18、信号的，故可以通过检测T淋巴细胞的CD3+/HLA-DR+、CD3+/CD25+等活化抗原来监测T淋巴细胞活化状态。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人CD3/HLA-DR和CD3/CD25进行测定，发现恶性肿瘤病人CD3+/HLA-DR+显著降低(P0.01)，表明活化T细胞减少，但其中并不说明没有产生活化T细胞，而是因总T细胞减少而导致其数值降低；CD3+/HLA-DR-升高，静止T细胞则相应增多(P0.05)；CD3-/HLA-DR-显著降低(P0.01)，表明活化B、NK细胞也减少；而CD3+/CD25+无显著变化(P0.05)；体外的活化T淋巴细胞试验证明，许多细胞因子可增强H

19、LA-DR的表达，如IFN、IL-1、TNF-2等，从而增强机体的细胞免疫功能和抗肿瘤效应21。本文对10例恶性肿瘤病人应用白介素-和高聚生治疗3个月后，所测活化T、B、NK淋巴细胞较治疗前显著升高(P0.01)，表明T、B、NK细胞开始活化，而CD3+/CD25+细胞无明显增加，可能与白介素-治疗病例较少有关。此外，本文检测结果还发现CD3+与CD3+/HLA-DR+呈正相关性(r=0.49，P0.01)。3.5 免疫治疗与肿瘤的关系 免疫既影响肿瘤生长，肿瘤的宿主也会发生免疫的改变，如果能使免疫低下的恶性肿瘤病人免疫功能得以调节，必然有利于肿瘤的控制。许多研究表明，患有肿瘤的个体可对肿瘤产

20、生免疫抑制。随着人们对人类肿瘤抗原分子的认识，肿瘤细胞具有抗原性并能引起抗体免疫应答是肿瘤免疫治疗的基础。免疫治疗作为癌症治疗方法的一种，主要通过宿主天然防御机制或天然哺乳动物材料做药物而发挥抗肿瘤效应，生物疗法是继手术、放疗、化疗之后，已成为癌症治疗的第四种重要方法。本文结果提示恶性肿瘤病人的免疫功能存在缺陷，免疫治疗可改善病人T淋巴细胞的数量和比例；同时，亦可直接刺激T淋巴细胞的活化，增强机体细胞和体液免疫功能。体外试验中，IL-2的使用提高了淋巴细胞对肿瘤的反应性22，IL-2用来刺激产生LAK细胞，LAK细胞可依一种非MHC限制方式识别新鲜肿瘤细胞，而不识别正常细胞2325，从而对肿瘤

21、细胞产生免疫应答。本文对10例恶性肿瘤病人进行高聚生、IL-2免疫治疗，并观察治疗前后各分子的变化，其中CD4+/CD3+、CD3+、CD4/CD8比值、NK细胞(CD3+/CD16+56+)、活化T淋巴细胞(CD3+/HLA-DR+)，活化B、NK细胞(CD3-/HLA-DR+)较对照组均显著性增高(P0.01)。这表明经过免疫治疗后，体内肿瘤分泌的可溶性免疫抑制因子减少，机体通过T细胞的免疫应答，导致CD4+T细胞活性加强，调节激活了T、B、NK细胞的功能，从而改善了机体的细胞免疫功能。1 毕爱华，龚非力.医学免疫学.北京：人民军医硔提 （，。）霭嫔纾?995，12-848.2 Gabri

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