液相色谱中缓冲液的配制

1、缓冲液流动相可以根据下面的操作步骤配制：1        将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液（溶液A）。2        用pH计确定或调节溶液A的pH。3        将一定体积（如200ml）的有机溶剂B与由步骤2配制的溶液A（如800ml）混合，制成最终流动相（此处的有机相为20%）。4        检查最终流动相的pH（此处为选项）。由于测定含有有机调节剂的流动相pH计发生漂移，使其测定pH不很可靠，所以上面的步骤4一般只有在

2、考察误差的主要来源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。步骤1一般是将配制缓冲液所用的两种试剂（A1和A2）分别按计算量先溶解在水中制成水溶液，然后再将这两种溶液按一定的比例混合得到预期pH的溶液A。若在此步骤2中调节pH，则可以采用溶剂A滴定溶剂B，也可反过来滴定，并通过pH计测量得到所需pH的最终缓冲溶液。在大多数实验室中，pH的测量精度通常不会达到±0.050.1个pH单位，这会显著影响一些样品的分离。当HPLC方法对pH非常敏感时，步骤2只能大致确定pH值。将准确称重的缓冲液配制试剂与精确体积的脱气蒸馏水混合，使其成为均一的溶液（不进一步调整pH），如此配得缓冲溶液的pH可以控制

3、在非常窄得范围内（±0.02单位），已知准确pH值的缓冲液浓溶液已有市售。为了改善峰形或塔板数，有时在流动相中加入酸或碱（如三乙胺、乙酸等），如果这些添加剂并非为配制缓冲溶液时所采用得试剂，那么将这些试剂加入到流动相中后，还需重新滴加酸或碱，使流动相达到所需的pH值。常用缓冲液的配制当缓冲液被稀释或浓缩时，pH也应不变。其pH值应近似恒定不变，或当其中的离解的阳离子（K+、Na+）或阴离子（Cl-、Br-）被其它种类的离子替换时。表14中给出了响应的配制方法，平衡阳离子为Na+，缓冲液的最终浓度为0.1mol/l，对于其它浓度的缓冲溶液或阳离子种类（通常K+）更好，表中的数据也可供参

4、考。较稀的或较浓的缓冲溶液，及包含有不同阳离子的溶液，其pH值会与表中的数据稍有出入。在方法建立过程中，精确的流动相pH值往往并不重要，重要的是每次新配制的流动相的pH值与第一次基本相同（最好控制在±0.02范围内）。注意，只有当缓冲溶液的pH在缓冲试剂解离常数pKIa±1范围内时，缓冲溶液才具有有效的缓冲容量（如乙酸盐的pKa=4.6，其适宜的pH范围为3.65.6）。表1 低pH值（25）磷酸盐缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.1M磷酸。配制精确pH值缓冲液时，所用磷酸需滴定H3PO4的含量。溶液A2：0.1M磷酸二氢钠溶液，称量13.8g NaH2PO4H2O溶解于水中

5、，定容于1L容量瓶中。 pH         A1体积（ml）         A2体积（ml）        pH         A1体积（ml）         A2体积（ml）2.0        565        435

6、60;       2.8        175        8252.2        455        545        3.0        110        8902.4        345    

7、0;   655        3.2        55        9452.6        250        750                        表2 不同pH值（25）醋酸缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.1M醋酸溶液。6.0g（5.8m

8、l）冰醋酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M醋酸钠溶液。8.2g C2H3O2Na（或13.6g C2H3O2Na3H2O）溶解于水中定容到1L容量瓶中。pH         A1体积（ml）         A2体积（ml）        pH         A1体积（ml）         A2体积

9、（ml）3.6        926        74        4.8        400        6003.8        880        120        5.0        296   

10、;     7044.0        820        180        5.2        210        7904.2        736        264        5.4       

11、 176        8244.4        610        390        5.6        96        9044.6        510        490            &

12、#160;           表3 不同pH值（25）柠檬酸缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.1M柠檬酸溶液。21.0g 柠檬酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M柠檬酸钠溶液。29.4g C6H5O7Na32H2O溶解于水中，定容到1L容量瓶中。pHA1体积（ml）         A2体积（ml）        pH         A1体积（ml）  

13、0;      A2体积（ml）3.0        930        70        5.0        410        5903.2        870        126        5.2  

14、0;     360        6603.4        810        190        5.4        320        6803.6        750        260       

15、; 5.6        270        7263.8        700        300        5.8        230        7644.0        660        340 

16、60;     6.0        190        8104.2        610        370        6.2        140        8564.4        560      

17、0; 440        6.4        60        9404.6        510        490        6.6        40        9604.8        460  

18、0;     540        6.8        30        9705.0        410        590        7.0        10        9855.2       

19、360        660表4 中等pH值（25）磷酸缓冲液的配制方法溶液A1：0.1M磷酸二氢钠溶液。13.8g NaH2PO4H2O溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M磷酸氢二钠溶液。26.8g Na2HPO47H2O（或35.9g Na2HPO412H2O）溶于水中，定容到1L容量瓶中。pH         A1体积（ml）         A2体积（ml）        pH

20、         A1体积（ml）         A2体积（ml）5.6         948        52        7.0        390        610 5.8        920

21、60;        80        7.2        280        7206.0        877        123         7.4        190         81

22、06.2        815        185        7.6        130        8706.4        735        265         7.8         85

23、60;        9156.6        685        315        8.0        53        947 6.8        510         490       

24、                 表5和6给出了适于pH=710.6范围的两种有机碱缓冲液配制方法，这种有机碱缓冲液可以有效低减缓硅胶基柱的柱效降低。表5 高pH（25）甘氨酸缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.2M甘氨酸。15.01g 甘氨酸溶于水中，定容于1L容量瓶中。溶液A2：0.1M NaOH溶液，稀释较浓的NaOH溶液。pH         A1体积（ml）         A2体积（ml）

25、        pH         A1体积（ml）         A2体积（ml）8.6        25        2.0        9.6        25        11.28.8    &#

26、160;   25        3.0        9.8        25        13.69.0        25        4.4        10.0         25      

27、0; 16.09.2         25        6.0        10.4        25        19.39.4        25        8.4        10.6       

28、25         22.75表6 高pH值（25）Tris缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.1M Tris（无碱），12.11g Tris溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M HCl溶液，稀释较浓HCl溶液。pH         A1体积（ml）         A2体积（ml）        pH        

29、 A1体积（ml）         A2体积（ml）7.1        50        45.7        8.1        50        26.27.2        50        44.7        8.2        50        22.97.3        50        43.4        8.3        50        19.97.4