第一代腺病毒载体重组的常见方法

1、1. 细胞内同源重组    这种方法需要在两个DNA分子之间进行重组，第一个DNA分子(即所谓穿梭载体，shuttle vector)含有腺病毒左侧的反向末端重复序列（LITR）、腺病毒包装信号（）等顺式作用元件以及目的基因表达盒和腺病毒基因组的左端一段序列；另一个DNA分子（即骨架载体，backbone vector）与第一个DNA分子的3端略微重叠，然后继续向右，包含有大部分的病毒基因组序列。两种DNA分子共转染入可以表达腺病毒E1区蛋白的细胞（如293、911以及PERC6等），并发生同源重组，即可得到预期的复制缺陷型重组腺病毒。其缺点是：容易受到亲代病毒的污染，必须

2、经过2-3次的病毒空斑纯化，并通过多次的嗜斑形成方法鉴定重组病毒。另外，重组效率低下，重组腺病毒通常需要花费两周左右的时间。虽说如此，本方法是构建腺病毒载体的经典方法，目前应用于临床的腺病毒载体都是以这种方法构建的。因此，若是构建重组腺病毒的最终目标是成功地应用于临床还是以这种方法为佳。而且难度是相对的，对于一个在构建重组腺病毒方面有着经验丰富的实验室而言，以这种重组方法在较短的时间内成功构建出重组腺病毒并非很困难。2. 位点特异性重组系统    位点特异性重组(site-specific recombination)是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同

3、源序列即特异性位点(又称附着点attachment site)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶只能催化特异性位点间的重组,不能催化其它任何两条同源或非同源序列之间的重组,因而重组具有特异性和高度保守性。据此，位点特异性重组又称保守重组(conservation recombination)，该重组过程不需RecA酶参与。目前应用较多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系统，其中Cre、FLP和BP均为特异性重组酶，属重组酶整合酶家族，它们催化的反应类型、靶位点及重组机制十分相似，loxP、FRT和attBP为特异性位点，也有相似的结构。我们将以Cre/loxP为

4、例作一简要介绍。    Cre基因表达产物为343个氨基酸的单聚体蛋白，分子量为38kDa，它是位点特异性重组发生所需的特异性重组酶,其识别位点被称为loxP(locus of crossing-over P1)，为一段34bp的DNA序列，由两个13bp的反向重复序列和一个8bp的不对称间隔序列(又称为核心序列)组成5-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3。loxP位点碱基重排后形成十字形的结构，核心序列形成一单链环，它为Cre重组酶切割的底物，也是DNA识别与重组的位点，对称的13bp反向重复序列是Cre重组酶结合的序列。位点特异性重

5、组酶Cre很特别，由它介导的重组反应不需要ATP或拓扑异构酶等辅助因子的参与；重组反应既可以发生于体内、外的活细胞内，也可以发生于无细胞系统之中；重组反应的底物形式多样，无论是源于动物、植物或微生物的DNA，还是线性、开环或超螺旋的DNA均适用。Cre的特定作用位点loxP的位置也极富变化，可以位于相同或不同的染色体或DNA分子上，loxP之间既可同向排列、也可反向存在。在同一个DNA分子上，Cre介导两个同向排列loxP位点之间的DNA的缺失反应(在DNA分子上留下一个loxP位点)，被切除的DNA分子呈环状。如果该环状结构具有质粒的基本元件和抗性基因，则可在用其转化大肠杆菌后形成抗性菌落。

6、如果两个loxP位点反向排列，Cre则诱发倒位反应。在不同的DNA分子上，Cre则介导缺失、重复、插入以及易位等反应。    Cre/LoxP位点特异性重组系统也是由穿梭载体和骨架载体构成，各含有一个同向排列的LoxP位点，其中骨架载体还含有由CMV启动子调控的Cre基因。将穿梭载体与骨架载体共转染包装细胞株（293、911以及PERC6等），骨架载体所携带的Cre基因开始表达，介导两个LoxP位点之间的重组，剪切掉骨架载体上的细菌内复制元件、抗性基因以及Cre基因，同时完成目的基因的插入。由于骨架载体虽然携带有大部分的腺病毒基因组DNA却缺少形成有感染能力腺病毒颗粒所必需

7、的包装信号（），而穿梭载体则刚好相反，因此只有在两个载体之间发生了重组，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重组腺病毒颗粒。通过这种方法转染710天后就能观察到病毒噬菌斑。这种方法比前一方法获得重组腺病毒的效率要高很多（约100倍），而且只要插入的外源基因不大于8Kb，那么几乎100%的重组腺病毒都携带有目的基因。不难看出，这是一种非常便捷的腺病毒重组方法，非常适用于在构建重组腺病毒载体方面经验较少的实验室。    最近，由BD公司推出了一套在体外利用Cre/LoxP位点特异性重组构建腺病毒载体的系统。该系统也是由一大（受体）一小（供体）两个质粒载体构成。供体载体包含两

8、个LoxP位点，分别位于多克隆位点的5端和氯霉素抗性基因（Cmr）开放阅读框的5端，另外还含有氨苄抗性基因（Ampr）和蔗糖酶B基因（SacB），前者用于在大肠杆菌中保持载体遗传性状的稳定，后者在重组后作负性选择之用。受体载体含有一个LoxP位点，紧随其后的是一个可以在 Cre/LoxP介导重组后调控Cmr表达的细菌启动子。三个LoxP位点为同向排列，在Cre酶的作用下同时发生多个重组反应，一部分重组反应将目的基因和Cmr转移到受体载体中。由于供体载体及其衍生物（由一些意外重组事件产生）中都含有SacB基因，在含蔗糖的培养基中不能生长，而受体载体及其衍生物在含氯霉素的培养基中不能生长，因此将重

9、组反应产物转化E.coli DH5并铺LB/Cm/蔗糖平板后，只有正确的重组子可以生长。将正确的腺病毒重组子用PacI酶消化，暴露其反向末端重复序列，转染低代293细胞，经过710天即可得到携带有目的基因的重组腺病毒。这种方法的优点是：酶切与连接步骤少；正确的重组机率高，可达90%以上；无需反复空斑纯化。3. 细菌内同源重组（AdEasyTM System）    这种方法的基本策略是：在大肠杆菌内通过同源重组的方法构建重组腺病毒质粒载体，经酶切线性化后再转染腺病毒包装细胞系（293、911以及PERC6等），从而得到腺病毒感染颗粒。与哺乳动物细胞比较，在大肠杆菌内进行挑克

10、隆、鉴定等操作无疑要便利许多，因此这种方法已被国内许多实验室所采用。然而，由于在大肠杆菌中腺病毒序列的遗传选择压力较小，发生突变导致腺病毒活力下降的可能性就大大高于前面提到的真核细胞内重组的方法。这种方法的共同特点是：重组系统由两种质粒组成，一种是包含有全部（或右侧大部分）腺病毒基因组DNA的大质粒（骨架质粒）；另一种是小的穿梭质粒，其带有目的基因表达盒以及在表达盒两侧的与大质粒上的目的基因拟插入部位同源的序列（左、右臂 Left & Right Arm）。这种方法通常的操作流程是：首先，将目的基因亚克隆到穿梭载体中，经过一个在穿梭载体左右臂之间的稀有的限制性内切酶消化，暴露其左右臂；

11、然后，与环化（或超螺旋）的骨架质粒载体共转化RecA酶阳性的大肠杆菌（如BJ5183），使二者发生同源重组，得到携带目的基因的腺病毒重组子质粒；再后，用另一稀有的限制性内切酶充分消化腺病毒重组子质粒，切除质粒上的原核细胞内复制元件及抗性基因等，使其线性化并暴露左右末端重复序列（ITR）；最后，转染腺病毒包装细胞系（293、911以及PERC6等），得到腺病毒感染颗粒。以AdEasyTM系统为例，构建流程如下：     AdEasyTM系统是由TONG-Chuan He博士等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。该系统的特点是：   

12、 1)有多种穿梭载体可供选择（pShuttle、 pShuttle-CMV、pTrack、和pTrack-CMV）。其中pTrack和pTrack-CMV携带有报告基因EGFP（绿色荧光蛋白），转染293细胞后可于荧光显微镜下直接挑选阳性克隆，非常直观、简便。    2)酶切和连接反应少，减化了操作步骤。    3)通过上面的流程图不难看出，当骨架质粒与线性化的穿梭质粒发生同源重组后，其抗性基因将由原来的氨苄抗性转变为卡那抗性，信噪比得到明显的提高。    4) E.coli BJ5183内的RecA酶是一种高效的同源重组酶，正确的同

13、源重组率在60%以上。    不足之处在于：该系统中的骨架载体需以超螺旋的形式（需经超速离心纯化才能获得）与线性化的穿梭质粒一起点穿孔转化E.coli BJ5183，才可以保证有较高的同源重组机率，这对于国内一些设备和技术相对落后的实验室而言无疑是有一定的难度的。另外如前所述，由于在大肠杆菌中腺病毒序列的遗传选择压力较小，发生突变导致腺病毒活力下降的可能性就大大高于前面提到的真核细胞内重组的方法，因此应多挑选几个重组子克隆转染293细胞，并从中选出重组病毒活力强、目的基因表达量高的克隆用于实验。我实验室在对该系统进行了一些改进后，使其更方便易行，更适合我国国情，并取得了较好

14、的效果。具体步骤见实验操作部分。4. 酶切连接    本方案的基本思路实在腺病毒质粒中通过连接反应插入一个表达盒，而不是进行同源重组。这个系统中也含有穿梭和骨架两种载体。大质粒含有除E1和/或E3区外的全部腺病毒基因组，其E1区缺失部位有两个非常罕见的由内含子编码的核酸内切酶位点（如，PI-Sce I和I-Ceu I）。穿梭载体较小、易于操作，用于将目的基因表达盒亚克隆到腺病毒骨架质粒载体中，在穿梭载体多克隆位点的两侧也含有上述特殊的酶切位点。首先将目的基因表达盒插入到穿梭载体中，用上述两种酶消化之，得到含有目的基因表达盒的穿梭载体片段与腺病毒骨架质粒（用两种酶预消化后）连接，转化E.coli DH5即可得到腺病毒重组子克隆，将其用PacI消化暴露其反向末端重复序列后转染低代293细胞，得到带有目的基因表达盒的重组腺病毒。这种方法的优点