心可宁胶囊质量标准研究

1、心可宁胶囊质量标准研究     【摘要】  建立心可宁胶囊的质量标准，以提高其质量标准。方法 采用薄层色谱法对方中主要药味丹参、牛黄、蟾酥、红花、三七、人参须进行定性鉴别研究，采用高效液相色谱法测定方中丹参酚酸B含量。结果 薄层色谱图谱清晰，专属性强，重现性好；HPLC法测定丹酚酸B含量在0.144 g1.44 g范围内线性关系良好0（r=0.9997，n=6），平均回收率为101.2%(RSD=2.1%,n=6)。结论 该方法快速简便，专属性强，重现性好，能有效地控制药品质量。为完善心可宁胶囊的质量标准提供了依据。 【关键词】  心

2、可宁胶囊 质量标准 薄层色谱 高效液相色谱    Abstract：Objective To establish the quality standard for Xinkening capsuleMethod Medicines in this description were identified by TLCThe content of salvianolic acid B which is the effective substance in the preparation was determined as the index by HPLCResult

3、s Medicines could be detected by TLC from three batches of samplesThe linear correlation of the salvianolic acid B is good in extent of 0.144g1.44g and the average recovery rate is 101.2%(RSD=2.1%,n=6)Conclusion The quality control is feasible and can be applied to control the products from mass pro

4、ductionIt can ensure the stability of the pharmaceutical quality.    Key words:Xinkening capsule;quality standard;TLC;HPLC   心可宁胶囊收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第九册，由丹参、三七、冰片、蟾酥、红花等药材加工而成的纯中药复方制剂。具有活血散瘀、开窍止痛的功效。用于冠心病，心绞痛，胸闷，心悸，眩晕。原质量标准仅对丹参、牛黄和蟾酥进行了定性鉴别，为了更有效地控制其内在质量，保证药品的安全、有效。本实验系统

5、的对方中其他药味的薄层鉴别方法进行了研究，增加了红花、三七、人参须的薄层色谱鉴别。由于丹参为加水煎煮，故可选择其水溶性成份作为质控指标，进行方法学研究建立了高效液相色谱法测定丹酚酸B含量的方法，并制定了相应的含量测定限度。本研究最终建立了准确、可控的质量控制方法，从而为心可宁胶囊质量标准的提高提供了可靠依据。    1  仪器与试剂  岛津LC-10A型高效液相色谱仪（SPD-10Avp紫外检测器，CTO-10Asvp柱温箱，LC-10Atvp双泵，N2000色谱数据工作站），色谱柱：DiamonsiLTM钻石C18柱（200 mm×

6、4.6 mm，5 m）；Auto Science AS5150A超声波清洗器；德国Sartoriu公司BP211D（十万分之一），BP121S（万分之一电子天平。    对照品：丹酚酸B（供含量测定用，111562-200403）、胆酸对照品（100078-200414）、三七皂苷R1（110745-200415）、人参皂苷Rb1（110704-200420）、人参皂苷Rg1（0703-200221）、人参皂苷Re（110754-200421）；对照药材：丹参对照药材（111562-200403）、蟾酥对照药材（121132-200001）、红花对照药材（1209

7、07-200408）均由中国药品生物制品检定所提供，甲醇、乙腈为色谱纯（fisher公司），水为超纯水；其他试剂均为分析纯。    2  方法与结果    2.1  显微特征鉴别    对红花花粉粒进行显微特征鉴别。取本品，置显微镜下观察：花粉粒球形或椭圆形，直径4080 m，外壁有短刺及疣状雕纹，具3个萌发孔。    2.2  薄层色谱鉴别    2.2.1  丹参的薄层鉴别  取本品10粒，倾

8、出内容物，加水20 ml，温热溶解，加稀盐酸调节pH值4左右，用乙醚提取三次，每次20 ml，合并乙醚液，用无水硫酸钠脱水，挥去乙醚，残渣用无水乙醇0.5 ml溶解残留物，作为供试品溶液。另取丹参对照药材7 g，加水煎煮3 h，滤过，滤液浓缩至约20 ml，加稀盐酸调节pH值4左右，用乙醚提取三次，每次20 ml，合并乙醚液，用无水硫酸钠脱水，挥去乙醚，用无水乙醇0.5 ml溶解残留物，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验1，吸取供试品溶液和对照药材各5 l，分别点于同一硅胶薄层板上，以苯乙酸乙酯甲酸(80508) 为展开剂，展开，取出，晾干，氨蒸气熏5 min后，置紫外光灯（365 nm）下检

9、视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。    2.2.2  牛黄的的薄层鉴别  取丹参鉴别项下剩余的供试品溶液，加无水乙醇15 ml稀释后，加少量活性炭脱色，滤过，滤液置水浴上浓缩至约0.5 ml，作为供试品溶液。另取胆酸对照品，加乙醇配制成每1 ml含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验1，吸取供试品溶液及对照品溶液各5 l ，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷乙酸乙酯冰醋酸(5152)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10硫酸乙醇溶液，105加热510 min后，置紫外灯（365 nm）下检视。

10、供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。    2.2.3  蟾酥的薄层鉴别  取本品10粒，倾出内容物，加三氯甲烷30 ml浸渍1 h，时时振摇，滤过，滤液置分液漏斗中，加氢氧化钠液(0.1 mol/L)20 ml，轻轻振摇，弃去氢氧化钠液；三氯甲烷液用水20 ml洗涤，弃去水洗液，三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，回收三氯甲烷，残渣加乙醇0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取蟾酥对照药材0.2 g，磨细，用三氯甲烷30 ml浸渍1 h，时时振摇，滤过，滤液回收三氯甲烷，残渣用乙醇10 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层

11、色谱法试验1，吸取供试品溶液20 l，对照药材溶液10 l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷丙酮环己烷(334)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸液，105加热1015 min，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。    2.2.4  红花的薄层鉴别  取本品10粒，倾出内容物，加水煎煮1次，煎煮1 h，滤过，滤液加乙醇调含醇量达70%，静置5 h，滤过，滤液回收乙醇后用乙酸乙酯萃取2次，每次20 ml，萃取液浓缩至1 ml，作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5 g，同法制

12、成对照药材溶液。照薄层色谱法试验1，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10 l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷乙酸乙酯（54）为展开剂，展开，取出，晾干，用氨蒸气熏5 min后，置紫外灯(365 nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。    2.2.5  人参须的薄层鉴别  取本品10粒，倾出内容物，加三氯甲烷40 ml，加热回流1 h，弃去三氯甲烷，药渣挥干溶剂，加水适量，搅拌润湿后，加水饱和正丁醇40 ml，超声处理30 min，滤过，滤液加3倍氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇

13、1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rb1、人参皂苷Re及人参皂苷Rg1，加甲醇制成每1 ml含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验1，吸取上述两种溶液各5 l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷乙酸乙酯甲醇水（15402210）10以下放置后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105烘至显色。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。    2.2.6  三七的薄层鉴别  取本品10粒，倾出内容物，加水适量，搅匀，再加水饱和正丁醇20 ml，密塞，振摇10 min，放置2 h，

14、滤过，滤液加3倍量以正丁醇饱和的水，摇匀，放置分层，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验1，吸取上述两种溶液各5 l，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷乙酸乙酯甲醇水(15402210) 10以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。         2.3

15、0; 冰片的理化鉴别    取本品2粒，倾出内容物，置蒸发皿中，上盖玻璃表面皿，在水浴上加热数分钟，取出；将玻璃表面皿上附着的白色结晶升华物取下，用少量乙醇使溶解，加新配制的1 香草醛硫酸溶液，即显紫色。    2.4  含量测定    2.4.1  色谱条件与系统适用试验  色谱柱为Diamonsil C18（4.6×250 mm，5 m），用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（3010359）；流速为1.0 ml/min；柱温为30；检测

16、波长为286 nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于3 000.    2.4.2  对照品溶液的制备  精密称取丹酚酸B对照品制成每l ml中含丹酚酸B 0.07mg的溶液。    2.4.3  供试品溶液的制备  提取溶剂考察：根据待测成分丹酚酸B易溶于甲醇及水的理化性质，选用了不同浓度的甲醇及水进行提取。取心可宁胶囊内容物粉末4份，每份0.25 g，分别加入65%甲醇、75%甲醇、85%甲醇,水50 ml，称定重量，超声提取30 min，放冷，补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液注入液相色

17、谱仪，记录峰面积值，以每克样品计算丹酚酸B的含量。结果表明，75%甲醇作提取溶剂时的提取效果最佳，因此选择75%甲醇作提取溶剂。    提取方法考察：常用的提取方法有回流提取法及超声提取法。本研究对这两种方法进行了比较。取心可宁胶囊内容物粉末2份，每份0.25 g，精密称定，加入75%甲醇50 ml，称定重量，分别回流，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液注入液相色谱仪记录峰面积值，计算样品中丹酚酸B的含量。结果表明,超声提取能更完全的提取出丹酚酸B，故选择超声提取。  

18、  提取时间考察：为了更完全地提取出丹酚酸B，确保含量测定的准确，本研究对提取时间进行了考察。取心可宁胶囊内容物粉末3份，每份0.25 g，精密称定，加入75%甲醇50 ml，称定重量，分别超声提取20、30、40 min，放冷，分别称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液注入液相色谱仪记录峰面积值，以每克样品计算丹酚酸B的含量。结果表明，丹酚酸B含量随提取时间而增加，当提取30 min时已近提取完全，故选择提取时间为30 min.    制备方法确定：取本品装量差异项下的内容物,研细，取0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇

19、50 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，取出，放置至室温后再称定重量，用75%甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。    2.4.4  方法学考察    阴性干扰试验：取处方中除去丹参的其他药材，按供试品溶液制备工艺制成阴性供试品溶液。分别吸取阴性供试品溶液、丹酚酸B对照品溶液和供试品溶液各10 l，注入色谱仪。 结果在与丹酚酸B对照品色谱峰相应位置处无色谱峰出现，见图1.    线性范围考察：精密吸取丹酚酸B对照品溶液0.014 4 mg/m

20、l、0.028 8 mg/ml、0.043 2 mg/ml、0.057 6 mg/ml、0.072 mg/ml、0.144 mg/ml 各10 l进样，记录色谱图，测定其峰面积。并以峰面积值（A）对进样量（C）进行回归，得标准曲线方程为:y=982 095x+10 956，R=0.999 7.结果表明，进样量在0.144-1.44g之间，进样量和积分面积线性关系良好。    精密度试验：精密吸取丹酚酸B对照品溶液（0.072 mg/ml）10 l，重复进样5次。试验结果表明：丹酚酸B峰面积的相对标准差RSD<2%，说明仪器精密度良好。  

21、  稳定性试验：取同一批样品，按含量测定项下方法制备样品，得样品供试品溶液；取供试品溶液与丹酚酸B对照品溶液，于0 h、1 h、2 h、4 h及8 h分别进样，每次进样量10 l，记录峰面积值。试验结果表明，丹酚酸B及样品供试液在8h内稳定性良好。    重复性试验：取同一批样品6份，分别按含量测定项下方法测定，计算丹酚酸B含量。结果表明，样品平均含量为15.07 mg/g，RSD<2%，所考察方法重复性良好。    加样回收率试验：取已知含量的样品（含量15.00 mg/g）胶囊内容物约0.12 g，精密称定，置于锥

22、形瓶中，分别加入丹酚酸B对照品溶液（0.481 6 mg/ml）4 ml，加入75%甲醇50 ml，称定重量，密塞，超声提取30 min，放置至室温后补足损失的重量，摇匀，滤过，照本品质量标准草案含量测定项下方法，进样10 l，测定，按下式计算回收率。6次试验的加样回收率测定结果均在95105%之间，其平均值为101.2%，RSD为2.1%.表明本方法可靠，符合含量测定的要求。结果见表1. 表1  回收率试验结果    2.4.5  样品含量测定    按供试品溶液制备方法处理10批样品，对其丹酚酸B含量进行了测定，每批平行测定2次。分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10 l，注入色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算含量。    3  讨论    本方共有八味药，通过研究，根据原标准，分别以丹参对照药材为对照对丹参进行薄层色谱鉴别研究，按原标准中的丹参薄层色谱鉴别进行试验，结果发现显色效果不佳，日光检视主斑点不清晰，故调整为以氨蒸气熏5min后，置紫外灯（365 nm）