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文档简介

1、一外周血淋巴细胞RNA提取1. 外周血淋巴细胞分离提取：10ml 人外周血血样（EDTA-2K抗凝管采集）稀释血样：DHanks 以1:1稀释加入淋巴细胞分离液（稀释血样：淋巴细胞分离液=2:1）室温，2000rpm/min 离心20min吸取单个核细胞层DHanks洗涤细胞1500 rpm/min 离心10minDHanks洗涤细胞1000 rpm/min 离心10min收集淋巴细胞沉淀（细胞计数：约1×107个细胞）2. 外周血淋巴细胞RNA提取：1×107个淋巴细胞中加入1ml TriZol，4静置5min，裂解加入200ul氯仿，上下颠倒至溶液出现浆白色，无分相现象

2、置于冰上5min；4，12000rpm/min，离心15 min将上层水相移入另一离心管，加等体积异丙醇，冰上孵育10min4，12000rpm/min，离心10 min弃上清，在沉淀（含RNA）中加1ml 75%乙醇洗涤4，12000 rpm/min，离心5 min，得到RNA沉淀；空气干燥后，用适量TE或无RNase水溶解备用RNA浓度：1400g/l，OD260/OD280=2.00淋巴细胞分离液：上海华精生物高科技有限公司标准号：Q/GHSB 85-2001 批号：040524二1st-Strand cDNA合成反应：1. 在Microtube中配制下列混合液试剂使用量Oligo dT

3、 Primer (50M1ldNTP Mixture (10mM each1l模板RNA Total RNA：5g以下（4l）RNase Free dH2OUp to 10l2. 65保温5min后，冰上迅速冷却。3. 在上述Microtube中配制下列反转录反应液，总量为20l。试剂使用量上述变性后反应液10l5×PrimerScript Buffer4lRNase Inhibitor (40U/l0.5l (20UPrimerScript RTase (200U/l1l (200URNase Free dH2OUp to 20l4. 缓慢混匀。5. 按下列条件进行反转录反应：42 30-60min，95 5min，冰上冷却。以PET28a为载体表达产物N端带有可以被thrombin酶切的组氨酸标签，上游primer：5-GGAATTCCATATGACCTGCTGCAGTCTACAC -3 (Nde I酶切位点以及保护碱基下游primer：5-CCGC

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