强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

1、强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响         11-05-11 15:48:00     编辑：studa20                     作者：陈凯佳刘小斌邱仕君周健洪 【摘要】  ：目的 观察强肌健力口服

2、液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖的影响。方法 使用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,5-溴脱氧嘧啶(Brdu)和CD44、CD54双重免疫组化鉴定,传3代后的MSCs分为强肌健力口服液含药血清组和空白血清对照组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测2组MSCs的生长情况。结果 强肌健力口服液含药血清组以浓度依赖方式促进MSCs的增殖活力,与相应浓度的空白血清对照组比较差异有显著性意义(P<0.05, P<0.01)。结论 补脾法(强肌健力口服液含药血清)能促进干细胞的生长。 【关键词】  补脾法强肌健力口服液骨髓间充质干细胞含药血清Abstract：Objec

3、tive To observe the effect of serum containing Qiangjijianli oral liquid in-vitro proliferation of rat mesenchymal stem cells (MSCs). Methods Rat mesenchymal stem cells dissociated from the bone marrow by density gradient method were cultured. MSCs were identified by marking of bromodeoxyuridine (Br

4、du) and staining of CD44, CD45. Experimental group was cultivated with serum containing Qiangjijianli oral liquid and control group with blank serum. Optical absorption value of MSCs was stained by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT). Results Serum containing Qiangjijianli oral liquid at different co

5、ncentrations could promote the proliferation of MSCs, the difference being significant in comparison with the control group (P<0.05 or P<0.01). Conclusion Invigorating the spleen (serum containing Qiangjijianli oral liquid) can enhance the proliferation of MSCs.Key words：invigorating the splee

6、n；Qiangjijianli oral liquid；mesenchymal stem cells；serum containing drug    骨髓间充质干细胞(MSCs)是干细胞中的一种,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点,并能在一定的诱导条件下向成骨细胞、成肌细胞等中胚层细胞分化,其应用前景极其广阔。本研究在邓铁涛教授“脾肾相关”的理论指导下,探讨补脾法(强肌健力口服液含药血清)对大鼠MSCs增殖的影响。1  材料与方法1.1  动物  &

7、#160; 纯种SD大鼠,SPF级,4周龄,体重90130 g,用于MSCs细胞的提取；纯种SD大鼠,SPF级,成年,体重180220 g,用于含药血清的制备,由广州中医药大学实验动物中心提供,许可证号：粤鉴证字2005A031SCXK(粤)2003-0001。1.2  主要试剂    IMDM培养基、特级胎牛血清、胎牛血清(FBS)：美国GIBCOL公司产品；链霉亲和素生物素复合物(SABC)、二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒、抗体CD44、抗体CD54、增殖细胞核抗原(PCNA)、生物素化二抗(羊抗小鼠)、AEC显色剂、BCTP/NBT显色剂：武汉博

8、士德公司；四甲基偶氮唑蓝(噻唑蓝,MTT)、5-溴脱氧嘧啶(Brdu)及其单克隆小鼠抗体：美国Sigma公司；D-Hanks液、TBS、PBS、2%台盼蓝染液、0.25%胰酶、马血清：广州威佳公司提供。1.3  强肌健力口服液含药血清的制备    强肌健力口服液(黄芪、党参、白术、当归、甘草等)由广州中医药大学新药开发中心提供,批号20040701,临床批件号2003L00874,含原药材1 204 g/L。采用成年SPF级SD大鼠,分为实验组、对照组,每组5只。实验组每日给予强肌健力口服液灌胃,灌胃剂量以50 kg体重成人的常规用量,按大鼠体重转换系数

9、计算,含原药材36.12 g/kg,连灌1周。对照组则给予等体积蒸馏水灌胃,连灌1周。最后1次灌胃后2 h,无菌条件下开胸取血,静置34 h,离心分离血清,取上清液,56 水浴灭活30 min,-20 保存,制备强肌健力口服液含药血清和空白对照血清。1.4  骨髓间充质干细胞的分离及体外扩增    取4周龄SPF级SD大鼠4只,10%水合氯醛腹腔麻醉注射。无菌条件下取双股骨及胫骨,收集骨髓腔内组织细胞。将细胞悬液分装,2 000 r/min离心20 min,密度梯度离心2次,收取单核细胞层,加入IMDM培养液,打散成细胞悬液。细胞悬液用2%台盼蓝染液染色

10、,计数300个细胞,调整密度,染成蓝色的死细胞小于5%方可继续实验,计数板计数,按1×104个/瓶密度接种于(7×5)cm2培养瓶中,置于37 、5%饱和湿度的CO2培养箱中培养,2 d后半量更换培养液,弃去未贴壁细胞。以后每3 d换液1次。细胞培养710 d后细胞密度较高,达90%融合后弃去培养液,加入D-Hanks缓冲液进行冲洗,0.25%的胰蛋白酶37 条件下消化510 min,镜下观察消化控制时间。当细胞形态开始变圆、漂浮、脱壁,立即加入血清终止消化反应。常规按12或13比例传代。1.5  骨髓间充质干细胞双标免疫组化检测   

11、; 传3代后的细胞种入装有IMDM空白培养基的24孔板中,24 h后固定；0.01 mol/L TBS洗2次(10 min,5 min),3% H2O2洗涤10 min,蒸馏水洗2 min×3次；正常山羊血清封闭20 min,甩去多余液体,一抗用多克隆兔抗,CD44、CD54(1100)4 过夜(对照组不加一抗,加TBS),0.01 mol/L TBS洗2 min×3次,生物素化羊抗兔37 40 min,TBS洗2 min×3,SABC-AP 37 40 min,TBS洗5 min×4次,BCTP/NBT显色30 min,双蒸水洗2 min×3次。双标阻断液30 min,0.01 MTBS洗2 min×3次,正常山羊血清封闭20 min,一抗用Brd