用冰冻兔血浆作血浆凝固酶试验的探讨

1、实验技术用冰冻兔血浆作血浆凝固酶试验的探讨于 梅 徐景野 傅小红 张思敏中图分类号:R446 5 文献标识码:B 文章编号:1007 0931(2001 06 0062 02作者单位:宁波市生防疫站, 宁波 315010血浆凝固酥试验阳性的金黄色葡萄球菌一般认为其致病性较强1。血浆凝固酶试验常以兔血浆作为凝固物质, 一些学者认为, 做金黄色葡萄球菌凝固酶用的血浆不宜冰冻。但基层实验室由于种种条件限制, 饲养动物有一定的困难, 致使新鲜兔血浆的来源受到限制。为此, 我们以兔血制成血浆后冰冻保存, 与新鲜兔血浆作比较, 并进行效期观察, 现将结果报告如下。材料与方法1 血浆制备1 1 兔血浆制备:

2、无菌采取兔心脏血, 以1份灭菌的3 8%枸橼酸钠液抗凝剂加4份兔血的比例充分混匀, 离心, 吸取上清液即为原兔血浆, 分装成1ml/支或0 5ml/支; 另用灭菌生理盐水稀释兔血浆, 制成4倍稀释血浆(以下简称为稀释兔血浆 , 分装同上, 于 18 以下冰冻保存, 供试验用。1 2 人血浆制备:无菌采取人静脉血, 抗凝方法同上, 离心制成新鲜人血浆, 用时1 4稀释。2 试验菌株 从食品、食物中毒、医院物体表面分离到的金黄色葡萄球菌168株,金黄色葡萄球菌参考株(AT CC25923 1株, 大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌各12株及未定型细菌26株、共255株。3 检测

3、方法 血浆凝固酶试验方法参照中华人民共和国国有标准方法进行2, 冰冻保存原兔血浆和稀释兔血浆当月隔天检测一次, 一个月后每周检测一次, 与新鲜兔血浆、人血浆作比较, 观察凝固时间、凝固强度。结 果1 与新鲜兔血浆比较 冰冻的原兔血浆和稀释兔血浆按国标方法进行血浆凝固酶试验, 以新鲜兔血浆为对照, 结果两种兔血浆在12个月内均能与不同来源的金黄色葡萄球菌和参考标准株发生凝固反应, 凝固时间为2 4小时, 其凝固强度与作比较的新鲜兔血浆一致, 符合率达到100%。保存12个月后冰冻的稀释血浆凝固时间逐渐延长, 凝固强度逐渐减弱, 而冰冻原血浆到18个月以后才出现这种情况。2 交叉反应 两种浓度冰冻

4、保存的兔血浆与大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌和未定型细菌作试验, 结果均未发生凝固反应, 也未与同属的表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌发生阳性反应。3 特异性测定 168株金黄色葡萄球菌中, 有一株菌株两种兔血浆凝固酶试验均为阳性, 而人血浆呈阴性反应。其余菌株反应结果一致, 符合率达99 4%。讨 论金黄色葡萄球菌是常见的化脓性疾病和食物中毒病原菌, 分布广泛, 肠毒素是该菌主要致病因子, 目前国内一般实验室开展金黄色葡萄球菌肠毒素测定的不多。血浆凝固酶与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关, 在通常情况下产肠毒素的金黄色葡萄球菌大多数血浆凝固酶阳性, 因此血浆凝固酶试验是确定金

5、黄色葡萄球菌必不可少的试验, 尤其是国内常以此项试验作为判断致病性金黄色葡萄球菌的主要依据。现行国家标准检验方法中规定用新鲜兔血浆作为凝固物质, 新鲜兔血浆一般仅能用一周, 这对基层实验室来说, 要不定期地获取新鲜兔血浆尚有一定的困难。我们参照国外冻干的兔血浆可保存冰箱中长期使用, 其凝固效果同新鲜兔血浆的报道3。根据国内实际情况, 将兔血浆贮藏在 18 冰箱中, 作冰冻环境的保存期限观察, 为方便使用对稀释兔血浆也作了相同的观察。结果稀释兔血浆在冰冻中保存12个月, 其凝固程度同新鲜兔血浆, 而冰冻原兔血浆保存效限则更长, 实验证实在这段时间内使用冰冻兔血浆的结果是可靠的, 说明冰冻兔血浆能

6、替代新鲜兔血浆, 这既极大地方便基层实验室对该项目的检测, 又提高了兔血浆的使用率。若能严格遵守无菌操作规程, 抽取一次兔血浆可使用二年以上, 节约了成本, 为广大基层实验室所能普遍接受。检测发现, 解冻后的兔血浆以一次用完为宜, 否则会导致试验的失败。作血浆凝固酶试验在兔血浆来源困难时, 一般会用人血浆代替, 但使用人血浆作血浆凝固酶试验时可发生假阴性4。究其原因, 可能是金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界, 与人类接触机会较多, 存在着凝固酶抗体; 其次, 由于 球蛋白的存在, 致使凝固酶受到一定程度的抑制; 此外, Ehrenkranz 等证明5, 人血清中有抑制葡萄球菌的物质。因此我们认为

7、作为凝固物质兔血浆优于人血浆, ,浆凝固酶试验首选凝固物质。参考文献1 Cow an, S. T. T he classification of staphylocoui by preciptation andbiological reacti ons. J. Palhol Bacteriol, 1983, 6:312 中华人民共和国国家标准. 食品卫生检验方法. 微生物学部分,GB4789. 10. 943 Difco supplementary literature. Detroil Difco Laboratories, 1990,564 孟昭赫主编. 食品卫生检验方法注解. 微生物学部

8、分. 北京:人民卫生出版社, 1990, 1055 Ehrenkranz. N. J. el at. Serum bactei astasis of staphylococcus.Infect Inimun, 1971, 8:664(收稿日期:2000 12 13顶空气相色谱法测定水中乙酸乙酯王惠华中图分类号:R123 1 文献标识码:B 文章编号:1007 0931(2001 06 0063 02作者单位:浙江省疾病预防控制中心, 浙江杭州 310009乙酸乙酯(沸点77 1 , 无色可燃性液体, 易着火,微溶于水。工业上常用作清漆稀释剂、人造革、硝酸纤维素、塑料等的溶剂。工业过程中管道的破

9、裂、废水的排放常使水体产生污染。水中乙酸乙酯的测定, 作者未见有关文献报道。本文采用顶空气相色谱法测定污染水源水中的乙酸乙酯, 具有操作简便、灵敏度高等特点, 现报告如下。材料与方法1 仪器 日本岛津GC 16A 气相色谱仪, 氢火焰检测器, 100 l 微量注射器, 135ml 顶空汽化瓶。2 试剂 乙酸乙酯(色谱纯 , 色谱固定相GDX 102, 无甲醇乙醇。3 色谱条件 色谱柱4mm 2m 玻璃柱; G DX 102(60 80目 ; 柱温:160 ; 检测器温度:180 ; 汽化室温度190 ; 载气流量:40ml/min; 氢气流量:50ml/min; 空气流量:500ml/min

10、。4 样品测定 取样品70ml (浓度高的样品适当稀释 置于135ml 顶空瓶中, 立即加盖密闭, 在恒温水浴中(75 1 保持40min, 取1ml 液上气进样, 记录峰高。5 标准曲线的绘制 准确称取800mg 乙酸乙酯, 以少量水洗入100ml 容量瓶中, 并加水稀释至刻度, 吸取10 0ml 标准溶液于100ml 容量瓶中, 加入无甲醇乙醇(控制乙醇含量在60% , 并加水稀释至刻度。该标准浓度为0 08g/100ml, 分别吸取该标准溶液25、50、75、100和150 l 于100ml 容量瓶中, 稀释至100ml, 后取70ml 至130ml 顶空瓶中, 在恒温水浴(75 1 中

11、保持40min, 取1ml 液上气进样以峰高定量。6 计算方法X=F I C 稀释倍数F S X 乙酸乙酯含量(g/100ml F I 样品峰高或面积F S 标准峰高或面积C 标准浓度(mg /100ml结果与讨论1 色谱分离 本法色谱条件可分离测定水中乙酸乙酯含量, 色谱分离图(见图1 , 乙酸乙酯保留时间为4 07min 。图1 乙酸乙酯色谱分离图2 标准曲线 经实验, 在浓度0 02mg /100ml 0 12mg /100ml 内相关系数为0 9926, 表明在该范围内线性良好。3 不同汽化温度与汽化时间的选择 在液上顶空气相色谱分析中, 待测组分的气相色谱响应值受不同的汽化温度与表1 水中乙酸乙酯的回收率试验样品本底测定(mg/100ml加入标准后样品实