柴胡总皂甙对戊四氮慢性点燃大鼠海马γ

1、柴胡总皂甙对戊四氮慢性点燃大鼠海马 【关键词】 柴胡总皂甙；戊四氮；癫痫；摘要：目的 研究柴胡总皂甙对戊四氮(PTZ)慢性点燃癫痫模型大鼠海马区氨基丁酸(GABA)表达的影响。方法 48只健康SD大鼠被随机均分为6组，即空白对照组(A组)、生理盐水组(B组)、丙戊酸钠(VPA)组(C组)和柴胡总皂甙高、中、低三种剂量组(D组、E组、F组)。除A组不做处理外，其他各组采用腹腔注射PTZ慢性点燃造模，造模同时给予VPA、柴胡总皂甙等不同处理因素，连续4周后取脑组织切片进行GABA免疫组化染色，从阳性细胞数、灰度值分析结果。结果 B组海马CA1、CA2、DG区的阳性细胞数高于其他各组(P0.05)，

2、而各区阳性细胞灰度值低于其他各组(P0.05)。结论 柴胡总皂甙可以影响PTZ点燃大鼠海马的GABA水平，发挥抑制PTZ对大鼠点燃的作用。关键词：柴胡总皂甙；戊四氮；癫痫；氨基丁酸；大鼠Effect of saikosaponin on GABA of hippocampus of chronickindling induced by pentylenetetrazol in ratsABSTRACT: Objective To study the effect of active ingredients (saikosaponin) of bupleurum chinensis D C. o

3、n GABA of hippocampus of chronic kindling induced by pentylenetetrazol (PTZ) in rats. Methods Fortyeight healthy SpragueDawley rats were randomly divided into six groups with eight in each group: normal control (Group A), normal saline (NS) group(Group B), sodium valproate (VPA) group(Group C), grou

4、p of largedose saikosaponin (Group D), group of mediumdose saikosaponin (Group E), and group of smalldose saikosaponin (Group F). Except Group A to be controlled, the other groups were given different treatments when chronically kindled by PTZ. The process of the test lasted for 4 weeks. After 4 wee

5、ks administration the brain tissues were sampled, sliced and stained by enzyme immunohistochemistry(EIH). The results were analyzed according to the positive cell population and gray value. Results The positive cell population of CA1, CA2 and DG in group B was significantly different from that in th

6、e other groups(P0.05). The gray value of CA, CA2 and DG in group B was significantly different from that in the other groups (P0.05). Conclusion Saikosaponin can influence GABA of hippocampus of rats ,and inhibit chronic kindling effect induced by PTZ.KEY WORDS: saikosaponin; pentylenetetrazol; epil

7、epsy; GABA; rat人类癫痫及痫性疾病大约占人口的1%-5%，其中约20%的患者对现使用的药物存在耐药性1，给治疗带来很大难度，临床需要新的抗癫痫药物。本课题组前期提出柴胡总皂甙能有效对抗戊四氮(PTZ)慢性点燃致痫作用，影响致痫大鼠脑电活动，并能抑制大鼠海马星形胶质细胞的异常激活。在本研究中我们继续探讨柴胡总皂甙对慢性点燃大鼠海马氨基丁酸(GABA)阳性细胞变化的影响，为柴胡总皂甙抗癫痫机制提供1.1 实验动物及分组 SPF级SpagueDawley(SD)大鼠48只，体重(20020)g，雌雄各半,购自南方医科大学实验动物中心(动物合格证号：2004B023)，饲养于南方医院动物

8、所。大鼠随机分为6组，每组8只(雌雄各半)：A组为空白对照组，B组为生理盐水组，C组为丙戊酸钠(VPA)组，D、E、F组分别为柴胡总皂甙高、中、低剂量组。1.2 药品、试剂与仪器 柴胡总皂甙粉购自上海医药工业研究院，批号050106； VPA为湖南湘中制药有限公司生产，批号050123；PTZ为Sigma公司生产，批号 064K0686；兔抗GABA及SABC免疫组化染色试剂盒购自博士德公司；切片机为Leica公司产品。采用PLA6XX Camera kit图像获取系统及Image tool 3.0图像分析软件。1.3 方法1.3.1 药液配制 应用生理盐水准确配制PTZ溶液(32.50g/L

9、)及柴胡总皂甙高、中、低3种质量浓度溶液(分别为15.60g/L、7.80g/L、3.90g/L)和VPA溶液(17.50g/L)，冷藏备用。40g/L多聚甲醛-0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.3)和PBS溶液临用前配制。1.3.2 PTZ慢性点燃癫痫大鼠造模及处理 各组均选用灌胃法给予处理。A组与B组给予等容积生理盐水；C组按87.5mg/kg给予VPA溶液；D组、E组和F组分别按照156、78、39mg/kg给予柴胡总皂甙溶液。每日上午8时左右给药，给药1h后，A组按10mL/kg生理盐水腹腔注射，其他各组按32.5mg/kg腹腔注射PTZ溶液，每日1次，连续4周。腹腔注射PTZ溶

10、液后观察记录大鼠痫性发作级别。痫性发作分级采用Racine标准，即0级：无发作反应；1级：节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛；2级：点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛；3级：出现前肢阵挛但不伴随直立；4级：前肢阵挛伴随直立；5级：全身强直阵挛发作而跌倒。凡连续至少5次2级以上痫性发作大鼠被认为慢性点燃致痫成功。1.3.3 GABA免疫组化染色 4周实验结束时，按常规制备大鼠海马石蜡切片，片厚3m。切片常规脱蜡、水化，3%(体积分数)H2O2去离子水孵育10min。热修复后，滴加抗原修复液1(ARS1)，室温10min，蒸馏水冲洗2min3；滴加5%(体积分数)BSA(bovine serum a

11、lbumin)封闭液，室温10min，滴加一抗(兔抗GABA稀释度为1100)4过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 20min。上两步之间用PBS冲洗，2min3次。滴加试剂SABC(链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物)，20-37 20min，PBS冲洗，5min4次；应用新鲜配制DAB显色，10min后水冲洗、复染、脱水、透明、封片。1.3.4 GABA阳性细胞计数及灰度值检测 应用OLYMPUS BH2型光学显微镜，高倍视野下(400)随机观察CA1、CA2、齿状回(DG)区的GABA阳性细胞数(每个区选择3个视野，计算均值)，运用PLA6XX Camera kit系统获取图片，并进一

12、步用Image tool 3.0图像分析软件分析细胞平均灰度值(每个阳性表达细胞的平均灰度值分为256度，最黑者为0度，最亮者为255度)。1.4 统计学处理 数据采用s表示，应用SPSS 10.0统计软件。计量资料的比较用方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 各组海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞数的比较 在CA1区，GABA阳性细胞数以B组最多，与其他5组比较有显着性差异(P0.05或P0.01)。在CA2区和DG区，GABA阳性细胞数也以B组最多，除F组外其余各组与其比较均有显着性差异(P0.05或P0.01，表1、图1)。提示在大鼠海马CA1、CA2、DG各

13、区，经PTZ慢性点燃后GABA阳性细胞数量明显增多，经柴胡总皂甙和VPA处理后，大鼠海马各区的GABA阳性细胞数量较模型鼠(生理盐水组)明显减少，接近于空白对照组，柴胡总皂甙高剂量组尤为明显。表1 柴胡总皂甙对海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞数的影响（略）Table 1 The effect of saikosaponin on positive cells of GABA in CA1, CA2 and DG of hippocampusA: normal control group; B: normal saline group; C: sodium valproate grou

14、p; D: group of largedose saikosaponins; E: group of mediumdose saikosaponin; F:group of smalldose saikosaponin The cases less than eight were lost during the experiment of EEG*P0.05, *P0.01 vs. group B2.2 各组海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞平均灰度值的比较及图片分析 在CA1和CA2区，GABA阳性细胞的灰度值以B组最低，与A、C、D、E组比较有显着性差异(P0.05)。在DG区也

15、以B组灰度值最低，与A、C、D组比较有显着性差异(P0.01，表2)。结合图1，大鼠海马GABA免疫反应阳性细胞分布广泛，细胞胞浆均匀染色，在各组均有表达。B组大鼠海马GABA阳性细胞呈线状排列，胞浆深染，说明B组阳性细胞染色深于其他各组，提示胞浆内GABA含量增加。图1 柴胡总皂甙对海马区GABA阳性细胞表达的影响（略）Fig.1 The effect of saikosaponin on positive cells of GABA in hippocampus (400)A: group A (normal control group); B: group B (normal salin

16、e group); C: group C (sodium valproate group); D: group D (group of largedose saikosaponin); E:group E (group of mediumdose saikosaponin); F: group F (group of smalldose saikosaponin) 表2 柴胡总皂甙对海马CA1、CA2、DG区GABA阳性细胞平均灰度值的影响（略）Table 2 The effect of saikosaponin on gray value of positive cells of GABA

17、in CA1, CA2 and DG of hippocampus the same as the group in Table 1 The cases less than eight were lost during the experiment of EEG*P0.05, *P0.01 vs. group B1Haberek G, Tomczyk T, Urbanska EM. Previous prolonged clonic seizures diminish antiepileptic activity of valproate against pentetrazolevoked c

18、onvulsions J. Pol J Pharmacol, 2001,53:8182.谢炜，鲍勇，于礼建，等. 柴胡总皂甙对PTZ慢性点燃大鼠痫性发作及脑电图的影响 J. 南方医科大学学报, 2006, 26(2):177180.谢炜，鲍勇，于礼建，等. 柴胡总皂甙对戊四氮慢性点燃大鼠海马内GFAP表达的影响 J. 南方医科大学学报, 2006, 26(4):452455.Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. . Motor seizure J. Electroenceph Clin Ne

19、urophysiol, 1972, 32:281294.黄运生，陈宝田. 癫痫从肝论治柴胡疏肝汤治疗癫痫108例疗效分析 J. 实用中医内科杂志, 2005,19(1):45.Ding R, Asada H, Obata K. Changes in extracellular glutamate and GABA levels in the hippocampal CA3 and CA1 areas and the induction of glutamic acid decarboxylase67 in dentate granule cells of rats treated with k

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