不同组织嗜性传染性支气管炎病毒核衣壳基因的遗传变异性分析

1、不同组织嗜性传染性支气管炎病毒核衣壳基因的遗传变异性分析周继勇1,张德勇1,2,丁红梅1,程丽琴1,陈吉刚1(11浙江大学动物预防医学研究所;21浙江大学生命科学学院杭州310029摘要:根据G enBank 发表的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus ,IBV Beaudette 毒株核衣壳(nucleocap 2sid ,N 基因序列设计一对特异性引物,利用RT -PCR 方法分别扩增了疫苗毒株IBV -H52、嗜腺胃Z J971株、嗜肾IBV -X 和N 株的N 基因ORF ,并克隆到质粒载体pBluescript SK (+,测序后用PCgene

2、和DNA Star 软件分析。结果显示:4株IBV 的N 基因均含有一个长1230bp 的ORF ,编码一由409个氨基酸残基组成的N 蛋白。嗜肾IBV -X 和N 毒株的N 基因存在Hin d 酶切位点。与来自G enBank 的另外8株IBV 比较,Z J971株与它们的N蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分别在8812%9816%和9112%9718%;N 株则分别为8616%8714%和9015%9115%;X 株分别为8613%8714%和9010%9115%;H52分别为9014%9813%和9210%9810%。Z J971株、N 和X 株的N 基因的突变特点是散在的点突变。嗜腺胃Z

3、 J971株核衣壳蛋白的氨基酸序列的最显著的遗传变异特征是H 111D 、S 117A 、V 142L 、P 171A 和E 401D ;嗜肾IBV -X 和N 株核衣壳蛋白的氨基酸序列的最显著的遗传变异特征是A 46S 、A 48P 、L 189R 、N 190S 、E 220D 、I 223A 、V 236Y 、S 237K 、K 240Q 、Q 286R 、T 299K 、R 301E 、E 334D 、V 335E 、V 336P 和T 351S 。关键词:传染性支气管炎病毒;核衣壳蛋白基因;克隆;变异中图分类号:S852165916文献标识码:A 文章编号:1000-8721(200

4、301-0059-05收稿日期:2002-01-14;修回日期:2002-03-26基金项目:国家自然科学基金(39970030;浙江省自然科学基金(399411;浙江省重点科研项目(991102030资助作者简介:周继勇(1963-,男,理学博士,教授,博士生导师,主要从事动物分子病毒学及畜禽传染病防治的研究及教学工作。Tel :0571-*;Fax :0571-*;Email :jyzhou zju 文中报道的序列在G enBank 的注册号为:AF352308、AF352310、AF352309、A Y043315。传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis viru

5、s ,IBV 属冠状病毒科冠状病毒属,能在鸡群中引起以呼吸道、肾脏和生殖道病变为主要特征的高度接触性传染性疾病。由于IBV 易变异,血清型众多,且各型之间交叉保护率低1,2,给传染性支气管炎的防治造成新的困难。IBV 的基因组为单链正股RNA ,长约27.6kb 3。在感染IBV 的鸡胚肾细胞中发现,IBV 指导合成6种主要的poly A 化的单股RNA 。这些RNA 包括基因组的胞内形式(RNA F 和5类较短的RNA (RNA A 、B 、C 、D 和E 4。mR 2NA A 、C 、E 分别编码三种主要的结构蛋白:纤突蛋白(S 、膜蛋白(M 和核衣壳蛋白(N 。S 蛋白转录后被切割成N

6、端的S1和C 端的S25。S1蛋白带有能诱导宿主产生中和抗体的抗原表位,并能决定病毒的血清型5,6。N 蛋白则有可能诱导机体产生针对IBV 的细胞免疫7。早期Williams 等的研究认为,不同IBV 之间N基因高度保守,尤其是中间区域8。但Sapats 认为N 基因的进化和变异与S1相似,具有一定的平行性9。Van 等的研究表明,IBV 的N 蛋白为409个氨基酸残基组成的一种磷酸化蛋白,在病毒的复制和转录中起一定作用10,11。同时N 蛋白还具有免疫原性,在感染过程中大量表达12,13。1995年后,国内先后有人分离到一种以鸡的腺胃肿大为致病特征的IBV 14,15。为了探讨IBV 遗传变

7、异的机理,我们在IBV Z J 971株、N 株和X 株的致病型及S1基因变异机理的基础上16-18,进一步分析了不同组织嗜性IBV 毒株的N 基因的遗传变异特征。材料与方法1病毒及载体IBV -Z J971(嗜腺胃毒株、N 和X (嗜肾毒株株由本实验室分离(19951999年间浙江省某些养殖场感染的鸡群14,16。IBV H52毒株购自中国兽药监察所。质粒载体pBluescript SK (+及大肠杆菌DH5(R -,M -,Amp -由本实验室保存。2试剂Trizol Reagent 购自GIBCO 公司。cDNA 合成试剂盒及UN IQ -5柱离心式胶回收试剂盒、Taq Plus DNA

8、Polymerase 、Eco R 、Hin d 、T4DNA 连接酶及dN TP Mix 等,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。3引物设计根据G enBank 已发表的IBV Beaudette 株核衣壳基因序列自行设计一对引物P1和P2。P1:5-CG第19卷第1期2003年3月病毒学报CHIN ESE JOURNAL OF VIROLO GY Vol.19No.1March 2003G AA TTC A TGGCAA GCGGTAAA GCA G-3与N基因5末端序列相同;P2:5-CCC AAG CTT ACTCAAAGTTCATT2 CTCTCC-3与N基因3末端序列互补。加框部

9、分为加入的酶切位点。4病毒繁殖及RNA的抽提将种毒接种10日龄SPF鸡胚,收获感染鸡胚尿囊液后用PEG6000以透析法将其浓缩近50倍。Trizol试剂抽提RNA。5RT-PCR用P2作引物,用反转录试剂盒合成cDNA 第一链。PCR反应体系为:反转录产物1l、灭菌双蒸水4015l,10×PCR buffer5l,dN TP Mix(10mmol/L1l,P1 (12mol/L1l和P2(12mol/L1l。95预变性5min后加入015l Taq Plus DNA聚合酶,942min,然后进入9445s,5545s,722min,共35个循环;72延伸10min。最后用1%琼脂糖凝

10、胶电泳检测PCR产物。6N基因的分子克隆及序列测定首先利用1%琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物,然后用胶回收试剂盒回收,得到纯化的PCR产物,产物和载体pBS质粒各自经Eco R、Hin d 37酶切215h。取pBS1l和PCR产物7l经455min 反应后,加入连接Buffer1l和T4DNA连接酶1l,16连接过夜,次日连接物经65灭活10min。转化感受态E1coli DH5,涂布于含Amp/X-gal/IPTG的固体培养基中,37培养18h20h。挑取白色菌落接种于LB液体培养基,37振荡培养12h。选取经过酶切及PCR鉴定的阳性克隆进行序列测定,每个毒株选2个克隆进行。7序列分析应用P

11、Cgene和DNA Star软件进行序列分析。结果1N基因的RT-PCR产物大小采用本试验设计的特异性引物,以IBV-Z J971、N、X和H52的基因组RNA为模板进行R T -PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,有一条分子量为1123kb大小的条带,与预期扩增的基因大小结果相符(图1。2N基因的限制性酶切片段分析取IBV-Z J971、H52、N和X毒株N基因的PCR产物,用Hi n d酶切,电泳检测发现IBV-Z J971、H52毒株不能被酶切,而IBV-N、X毒株被切成0.4kb和0.8kb两条带,说明IBV-Z J971、H52与N、X具有不同的基因类型(图2。3N基因重组子质粒鉴定及核

12、苷酸序列测定含有IBV-Z J971、H52、N和X毒株N基因的重组质粒进行PCR扩增后,可获得一条1.23kb的条带,证明IBV-Z J971、H52、N和X毒株N基因已被克隆到载体pBS SK(+中。重组质粒经核苷酸序列测定,IBV-Z J971、H52、N和X毒株N基因的ORF由1230bp组成,编码409个氨基酸;它们的G enBank Accession number分别为AF352308; AF352310、AF352309、A Y043315,序列分析发现,在X和N株868位处有一个Hi n d的酶切位点 。图1RT-PCR产物电泳结果Figure1Result of RT-PC

13、R amplification ofnucleocapsid protein gene of IBVM.Marker(3000bp-100bp;11IBV-Z J971strain;2.IBV-H52 strain;3.IBV-X strain;4.IBV-N strain.图2RT-PCR产物Hin d酶切分析Figure2Restriction endonuclease Hin dmap ofRT-PCR product of nucleocapsid proteingene of IBVM.Marker(3000bp-100bp;1.IBV-X strain;2.IBV-N strain

14、; 3.IBV-Z J971strain;4.IBV-H52strain.4不同组织嗜性IBV毒株N基因核苷酸及编码氨基酸的结构分析IBV-Z J971、H52、N和X毒株与来自G enBank 的IBV-Beaudette、M41、Ark99、Cu/T2、D1466、De072、Vic S、Gray株比较,Z J971株与它们的N蛋白的核苷酸序列同源性在8812%9816%,氨基酸序列同源性在9112%9718%;N株则分别为8616%8714%和9015%9115%;X株分别为8613%8714%和9010%9115%;H52株分别为9014%9813%和9210%9810%(表1。IBV

15、-Z J971、H52、N和X毒株N基因核苷酸与来自G enBank的IBV-Beaudette、M41、Ark99、6病毒学报19卷Cu/T2、D1466、De072、Vic S、Gray株比较,X和N 株N基因的核苷酸序列共发生128个点突变,这些点突变呈散在分布,涉及整个ORF,但在500750位及850900位之间突变率较高,分别达19%和24%。同时,X株和N株皆存在15个连续点突变。而Z J971与其它毒株相比,散在分布有59个点突变,仅存在5个连续突变。表1IBV的N蛋白基因核苷酸及推导氨基酸序列的同源性(%Table1Identity of the nucleotide and

16、 the deduced amino acid sequences of nucleocapsid protein gene of IBV strains Strain Z J971H52N X Beaudette M41Ark99Cu/T2D1466De072Vic S Gray Z J97191108710861791109017931195199816921888129213 H5292108712871292189813931891189016921390149219 N90179110991787118619871486198616871286178710 X901090179818

17、87118619871486178613871186178710 Beaudette91159411901590129315921591149016911589139211 M4191159810901790159317931791189016921389189219 Ark9993129414911591159312941495109310961389169613 Cu/T294169217901790129117921794149519941988169412 D146697189210901790109115921093179516921987189213 De0729312931491

18、1291109212931496119419941188199516 Vic S91129317911090179314921792179112911592178815 Gray92109314901790179214931495149314921495119214Amino acid sequence on the left;nucleotide sequence on the right.虽然N基因核苷酸的点突变较多,X株和N株N蛋白的氨基酸序列分别仅有17个和18个氨基酸位点发生点突变,而Z J971株有15个位点发生点突变,显然N基因核苷酸突变有较多的静默突变。IBV-Z J971、N

19、和X毒株N基因蛋白变异的共同点是以氨基酸的点突变为特征,且呈散在分布,但IBV嗜肾X和N株主要集中第189336位。与G enBank中仅存的8个IBV株的N基因蛋白氨基酸序列比较,发现第46、48、64、73、80、108、118、194、237、299、351、360、366位为高发性突变位点,突变率高达25%42%。根据N基因核苷酸和推导出的氨基酸序列的同源性,应用DNA Star软件分析N基因进化(图3,结果显示:这些IBV-Z J971、N、X、H52等12个病毒株可分成3组,其中第组包括Z J971、D1466和Cu/T2、Ark99、De072、Gray株,其中Z J971和D1

20、466株亲缘关系最密切;第组包括Beaudette、H52、M41和Vic S株;第组包括N和X株,IBV 嗜肾毒株与上述被分析的毒株亲缘关系较远 。图3N蛋白系统进化树Figure3Phylogenetic tree of nucleocapsid protein of some IBV strains讨论根据临床病变特征,IBV毒株主要可分为嗜呼吸道、嗜肾和嗜腺胃毒株三类。Ark99、Vic S、D1466、M41、De072、H52、Cu/T2、Beaudette株为嗜呼吸道毒株,Gray、X、N株为嗜肾毒株16,Z J971株为嗜腺胃毒株14,17。已有实验证实,N蛋白与基因161期周

21、继勇等:不同组织嗜性传染性支气管炎病毒核衣壳基因的遗传变异性分析组RNA包装信号序列的相互作用(N-RNA有助于病毒mRNA的合成和螺旋状核衣壳的形成19,20。冠状病毒的N-RNA相互作用较之非冠状病毒高效,提示N蛋白可能参与调节病毒RNA 的复制和转录21,22。本研究从N基因的核苷酸序列及其编码的蛋白分析,嗜腺胃IBV-Z J971株N 蛋白的不同于其他组织嗜性,IBV的显著特点是, 111、117、142、171和401位的氨基酸突变,即H111 D、S117A、V142L、P171A和E401D;嗜肾IBV-N株和X株N蛋白不同于其他组织嗜性IBV特有的突变是,46、48、189、1

22、90、220、223、236、237、240、286、299、301、334、335、336、351位氨基酸的突变,即A46 S、A48P、L189R、N190S、E220D、I223A、V236Y、S237K、K240Q、Q286R、T299K、R301E、E334D、V335E、V336P和T351S;X、N株与其他IBV具有很远的亲缘关系。嗜肾IBV-N株和X株N蛋白氨基酸的变异特征,与Williams等人的“N蛋白中间区域尤其保守”的观点不一致8。因此,我们认为嗜腺胃IBV-Z J971株、嗜肾IBV-N株和X株各自均存在不同于呼吸型IBV毒株的特征,是IBV新的变异株。同时IBV 组

23、织嗜性的形成和改变可能与N基因的变异有关。从N基因角度我们发现,嗜腺胃IBV-Z J971株与荷兰的疫苗株D1466关系具有很高的同源性和最近亲缘关系,而Z J971株S基因具有与M41株的S基因同源性较高和亲缘关系最近的特征18,因此从进化角度分析,嗜腺胃IBV毒株S基因与N基因变异不一致。我们认为Z J971是一重组病毒,就其形成机制,嗜腺胃IBV来源可能是其他组织嗜性IBV在动物体内某种酶作用下发生突变所致。参考文献:1Jia W,K araca K,Parrish C R,et al.A novel variant of avian infec2tious bronchitis vir

24、us resulting from recombination among three dif2 ferent strainsJ.Arch Virol,1995,140:259271.2Cavanagh D,Naqi S A.Infectious bronchitisA.Calnek B N,BarnesC W,McDougald L R et al.Diseases of PoultryM.Tenth edition1Iowa University Press,Ames Iowa,19971511-526.3Boursnell M E G,Brown T D K,Foulds I J,et

25、al.Completion of thesequence of the genome of coronavirus avian infectious bronchitis virusJ.J G en Virol,1987,68:57-77.4Stern D F,K ennedy S I T.Coronavirus multiplication strategy.I.I2dentification and characterization of virus-specified RNAJ.J Vi2 rol,1980,34:665-674.5Canvanagh D,Davis P J,Pappin

26、 D J C,et al.Coronavirus IBV:par2tial amino terminal sequencing of spike polypeptide S2identifies the sequence Arg-Arg-Phe-Arg-Arg at the cleavage site of thespike precursor polypeptide of IBV strains Beaudette and M41J.Virus Res,1986,4:133-143.6Cavanagh D,Davis P J,Darbyshire J H,et al.Coronavirus

27、IBV:virusretaining spike glycopolypeptide S2but not S1is unable to induce virus-neutralizing or hemaglutination inhibiting antibody,or induce chicken tracheal protectionJ.J G en Virol,1986,67:1435-1442.7Boots A M H,Benaissa-Trouw B J,Hesselink W,et al.Induction ofanti-viral immune responses by immun

28、ization with recombination-DNA encoded avian coronavirus nucleocapsid proteinJ.Vaccine, 1992,10:119-124.8Williams A K,Wang L,Sneed L W,et al.Comparative analysis ofthe nucleocapsid genes of several strains of infectious bronchitis virus and other coronavirusJ.Virus Res,1992,25:213-222.9Sapats S I,As

29、hton F,Wright P J,et al.Novel variation in the N pro2tein of avian infectious bronchitis virusJ.Virol,1996,226:412-417.10Van der Meer Y,Snijder E J,Dobbe J C,et al.Localization ofmouse hepatitis virus nonstructural proteins and RNA synthesis in2 dicates a role for late endosomes in viral replication

30、J.J Virol, 1999,73:7641-7657.11Denison M R,Spaan W J,Van der Meer Y,et al.The putative heli2case of the coronavirus mouse hepatitis virus is processed from the replicase gene polyprotein and localizes in complexes that are active in viral RNA synthesisJ.J Virol,1999,73:6862-6871. 12Ndifuna A,Waters

31、A K,Zhou M L,et al.Recombinant nucleocapsidprotein is potentially an inexpensive,effective serodiagnostic reagent for infectious bronchitis virusJ.J Virol Methods,1998,70(1:37 -44.13Seah J N,Yu L,Kwang J.Localication of linear B-cell epitopes oninfectious bronchitis virus nucleocapsid proteinJ.Veter

32、inary Mi2 crobiology.2000,75:11-16.14周继勇.传染性腺胃炎病毒(暂定名Z J971株的一些生物学特性J.畜牧兽医学报,2000,31(3:227-234.15荣骏弓,吴东来,谷守林,等.腺胃病变型传染性支气管炎病毒强毒株的培育J.中国兽医学报,2001,21(4:327-330.16周继勇,于涟,马有智,等.鸡肾型传染性支气管炎病毒分离及鉴定J.浙江农业大学学报,1998,24(3:303-307.17周继勇.鸡传染性腺胃炎病毒(暂定名的致病性J.中国兽医学报,2000,20(2:124-127.18周继勇,沈行燕,程丽琴,等.新变异的禽传染性支气管炎病毒Z

33、 J971毒株S基因克隆及序列分析J.中国农业科学,2001,34(4:445-450.19Zhou M L,Collisson E W.The amino and carboxyl domains of theinfectious bronchitis virus nucleocapsid protein interact with3ge2 nomic RNAJ.Virus Res,2000,67:31-39.20Zhou M L,Williams A K,Chung S,et al.The infectious bronchitisvirus mucleocapsid protein bi

34、nds RNA sequences in the3terminus of the genomeJ.Virology,1996,217:191-199.21Nelson G W,Stohlman S A,Tahara S M.Interaction between nu2cleocapsid protein and leader/intergenic sequence of mouse hepatitis virus RNAJ.J G en Virol,2000,81:181-188.22Cologna R,Spagnolo J F,Hogue B G.Identification of nuc

35、leocapsid26病毒学报19卷binding sites within coronavirus -defective genomesJ .Virology ,2000,277:235-249.G enetic V ariance Analysis of Nucleocapsid Protein G ene of Infectious Bronchitis Viruses with Different Tissue T ropismZHOU Ji -yong ,ZHAN G De -yong ,DIN G Hong -mei ,CHEN G Li -qin ,CHEN Ji -gang(I

36、nstit ute of Preventive Veteri nary Medici ne ,Zhejiang U niversity ,Hangz hou 310029,Chi na Abstract :Two specific primers were designed according to the published sequence of nucleocapsid (N protein gene of strain Beaudette of infectious bronchitis virus (IBV from G enBank.cDNA of N gene was ampli

37、fied by re 2verse transcription polymerase chain reaction (R T -PCR from viral RNAs of proventriculopathogenic IBV strain Z J 971,nephropathogenic IBV strains N ,X and IBV vaccine strain H52res pectively.They were cloned into vec 2tor pBluescript SK (+and sequenced by the dideoxy -mediated chain terminat