实验四、凝胶DNA回收

1、实验四、凝胶实验四、凝胶DNA回收回收一、概论一、概论DNA经琼脂糖凝胶电泳分离后，有效地回收特定的DNA片段是进行随后DNA克隆的一个主要步骤。回收的DNA片段的质量的好坏将严重影响DNA转化的效率。目前虽然有许多方法可从凝胶中回收DNA，如透析袋电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、琼脂糖酶法及DEAE-纤维素膜法等，但普遍存在以下问题： 1 大片段DNA不容易回收。 2 回收的DNA中存在酶反应抑制物 3 少量DNA片段的回收率低。 二、实验方法二、实验方法 V-gene V-gene 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶DNADNA的回收试剂盒的回收试剂盒1 1、 试剂试剂塑料件：DNA制备管，2ml离心管。

2、DE-A溶液：凝胶熔化剂(含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解)。室温密闭贮存。DE-B溶液：高离液序列溶液(促使大于100bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上），室温密闭贮存。W1溶液： 洗涤液。室温密闭贮存。W2溶液：脱盐液。室温密闭贮存。洗脱液：2.5mM Tris.HCl,pH8.5。室温密闭贮存。2 2、实验步骤、实验步骤A. 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体体积(如100mg=100ul体积).B. 根据凝胶浓度，按下表所提供的参数加DE-ADE-A溶液溶液： 凝胶浓度

3、 DE-A溶液体积 1.0 3个凝胶体积 1.5 4个凝胶体积 20 5个凝胶体积 混合均匀后于70加热(低熔点琼脂糖凝胶于40加热)，间断摇晃，直至凝胶块完全熔化(约6-8min).C. 在滤液中加0.5个DE-A体积的DE-BDE-B溶液溶液，混合均匀。当分离 的DNA片段小于400bp时，加入异丙醇至终浓度为20%。2 2、实验步骤、实验步骤( (续）续）D. 吸取步骤C中的混合液，转移到DNADNA制备管制备管(置于2 ml离心管)中，3600 rpm 离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1min, 弃滤液。E. 将制备管置回离心管，加0.5ml W1W1溶液溶

4、液，3600rpm离心30s，弃滤液;F. 将制备管置回离心管，加0.7ml W2W2溶液溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。再以同样的方法洗涤一次。G. 将制备管置于离心管中，最高速度离心1min;H. 将制备管置于新的1.5ml离心管中，在DNADNA制备膜制备膜正中央加 25ul水或洗脱液温静置1min。最高速度离心1min洗脱DNA。I. 收集洗脱液，保存于-20，电泳检测DNA片段回收情况。 3 3、注意事项、注意事项A.以下操作步骤适于从TAE或TBE琼脂糖泳胶中提取DNA。从其它缓冲液电泳胶中提取DNA时，加入DE-B溶液后溶液的pH应调整到65以下(步骤C)。B.在步骤A中，将疑胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时 间(线型DNA长时间暴露在高温条件下易于水解)，从而提高回收率。勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。C.在步骤B中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA回收率。D.如采用离心法，在步骤5B中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次，