第四章 电泳技术

1、第四章第四章 电泳技术电泳技术第第一一节节前前言言首次应用于生物学首次应用于生物学首次称为电泳首次称为电泳一、一、电电泳泳 历历 史史+-+-电泳前电泳后：阳极粘土颗粒上移，浑浊 阴极清澈，水面上升Tiselius 电泳槽（C）和电极（V1和V2）TiseliusTiselius和移动界面电泳和移动界面电泳 获诺贝尔奖，证明了血清是由白蛋白、获诺贝尔奖，证明了血清是由白蛋白、 、 、 球蛋白组成的。球蛋白组成的。电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pHpH值大值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，于蛋白

2、质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带正电荷，向负在电场中向正极移动，反之则带正电荷，向负极移动。极移动。当蛋白质溶液当蛋白质溶液pHpH值与蛋白质的等电点相等，静值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。电荷为零时则不移动。二、二、电泳的分类电泳的分类（一）按分离的原理区分（一）按分离的原理区分：1 1、区带电泳、区带电泳 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出扫描可得出个个互相分离的峰个个互相分离的峰2 2、移界电

3、泳、移界电泳 它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。作图，则得出一个个台阶状的图形。3 3、等速电泳、等速电泳 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。4 4、等电聚焦、等电聚焦 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成场中自动形成p

4、HpH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。聚成很窄的区带，分辨率很高。（二）按有无固体支持物区分（二）按有无固体支持物区分五十年代后，才开始固体介质电泳五十年代后，才开始固体介质电泳总之，各种电泳技术具有以下特点：总之，各种电泳技术具有以下特点：一、一、TiseliusTiselius移界电泳法移界电泳法TiseliusTiselius的移界电泳法具有重要的历史意义，它的移界电泳法具有重要的历史意义，它的成功在于巧妙地解决了几个问题：的成功在于巧妙地解决了几个问题：能够形成清晰的起始界面；能够形成清晰的起始界面；靠密度梯度能够稳定

5、界面；靠密度梯度能够稳定界面；能良好的散热；能良好的散热；在泳动过程中可用光学方法显示其组分。在泳动过程中可用光学方法显示其组分。第二节第二节 常用的电泳技术常用的电泳技术二、区带电泳二、区带电泳3 3、连续电泳、连续电泳用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，由上方连续加样，由上方连续加样，缓冲液连续由上方流下来，电极缓冲液连续由上方流下来，电极加在左右两方，电场方向与液流加在左右两方，电场方向与液流方向垂直。方向垂直。分离的成分由下方分别以试管收分离的成分由下方分别以试管收集集4、凝胶电泳、凝胶电泳实验步骤实验步骤制制 胶胶9090以上熔化，凝胶温度以上熔化，凝胶温度3

6、5-43 35-43 1、孔深、孔深 2、预留尺寸、预留尺寸 3、梳子宽度、梳子宽度 1+2= 胶的厚度胶的厚度-+加缓冲液加缓冲液拔梳子拔梳子-+点点 样样-+电电 泳泳DNA空间结构电压 EB脉冲电场（脉冲电场（PFGE） 解决大分子解决大分子DNA电泳问题电泳问题 几个原理及名词：几个原理及名词：1xSDS : 1xSDS : 50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8) 50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8)100 mmol/L DTT100 mmol/L DTT2% SDS 0.1% 2% SDS 0.1% 溴酚蓝10% 甘油Tris Tris 碱 用盐酸一次调PH

7、成功0.1% SDS0.1% SDS1xTris 1xTris 甘氨酸 : : 25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸 (PH8.3)(PH8.3)0.1 % SDS0.1 % SDS主要试剂及相关问题：主要试剂及相关问题：1、Acr 和和 Bis 比例比例 29：1 ，此时分辨率最佳，此时分辨率最佳 ，凝胶成透明；，凝胶成透明；Bis多硬无弹性。多硬无弹性。 避光室温保存，隔几个月重配。避光室温保存，隔几个月重配。神经毒！神经毒！2、SDS 电泳级电泳级 10%母液，室温储备。母液，室温储备。 刺激呼吸系统！刺激呼吸系统！3

8、、分离胶、浓缩胶的、分离胶、浓缩胶的Tris 缓冲液缓冲液 PH 6.8 PH 8.8 主要试剂及相关问题：主要试剂及相关问题：4、TEMED (四甲基乙二胺四甲基乙二胺) 通过催化过硫酸铵形成自由基，加速通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr Bis 聚合。低聚合。低PH聚合反聚合反应受到抑制。应受到抑制。 吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！明火！5、过硫酸铵、过硫酸铵 提供引发聚合反应的自由基。提供引发聚合反应的自由基。10% 4保存，保存， 每周新配！每周新配！6、Tris-Gly Buffer 安全！安全！凝胶浓度及其分离范围凝胶浓度及其

9、分离范围丙烯酰胺浓度线性分离范围/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212安装玻璃板安装玻璃板灌注分离胶灌注分离胶加水膜加水膜约约30min 后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体灌注浓缩胶灌注浓缩胶灌满！灌满！根据需要插入不同的梳子根据需要插入不同的梳子30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！左右加电泳缓冲液，再拔梳子！拔梳子后形成点样孔拔梳子后形成点样孔孔周围有膜，用针拨开孔周围有膜，用针拨开点样，电泳点样，电泳-+蛋白质电泳中蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有凝胶检测常采用的染色方法有考考马斯

10、亮蓝、马斯亮蓝、硝酸银染色、硝酸银染色、荧光染色法。荧光染色法。 染染 色色染色液配制：染色液配制： 0.1% 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 (先用甲醇充分溶解先用甲醇充分溶解) 50% 甲醇甲醇 10% 冰乙酸冰乙酸 40% 蒸馏水蒸馏水 滤纸过滤滤纸过滤脱色液配制：脱色液配制： 10% 甲醇甲醇 10% 冰乙酸冰乙酸 80% 蒸馏水蒸馏水5倍体积染色倍体积染色4小时以上，小时以上，脱色摇床，中间更换几次脱色液脱色摇床，中间更换几次脱色液硝酸银染色硝酸银染色银染的机制银染的机制:来来源于源于摄影银染技术摄影银染技术,是将蛋白分子是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。结合的银离子还原作成金属

11、银。优点优点:检测灵敏度高检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高要高50-100倍倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而而且所需的上样量较少且所需的上样量较少(每点仅需每点仅需0.1)。缺点缺点:可重复性差可重复性差 耗费人力耗费人力 质谱测定有一定的干扰质谱测定有一定的干扰染色方法染色方法化学显色化学显色光显色光显色双胺染色双胺染色非双胺非双胺 染色染色是利用是利用氨水同硝酸银氨水同硝酸银进行反应产生银进行反应产生银-双胺络双胺络合物合物,将固定后的凝胶浸泡其中将固定后的凝胶浸泡其中,再通过酸化再通过酸化使其显色使其显色是将固定好

12、的凝胶浸泡于酸性的硝酸银中是将固定好的凝胶浸泡于酸性的硝酸银中,在在硝酸银和蛋白质发生作用后在碱性条件下硝酸银和蛋白质发生作用后在碱性条件下,用用甲醛还原使其显色。甲醛还原使其显色。是使用是使用光能还原银离子成金属银光能还原银离子成金属银。因为光能够在酸性。因为光能够在酸性PH还原银还原银,所以一旦凝胶被固定所以一旦凝胶被固定,光显色能使用单一染色溶液光显色能使用单一染色溶液,而不像化学染色程序那样通常需要两种溶液。而不像化学染色程序那样通常需要两种溶液。硝酸银染色硝酸银染色分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差效应；长度仅仅相差0.20.2( (即即500500bpbp中的中的1 1bpbp) )的的DNADNA分子即可分子即可分开分开所能装载的所能装载的