第二章基因工程

1、第二章第二章 基因工程基因工程1基因工程基因决定性状（一）基因决定性状（一）青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素青霉素 2基因工程第一节第一节 基因工程概况基因工程概况基因决定性状（二）基因决定性状（二）豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮基因工程基因决定性状（三）基因决定性状（三）家蚕能够吐出蚕丝为人类利用家蚕能够吐出蚕丝为人类利用基因工程定向基因改造设想定向基因改造设想5基因工程6发现限制性内切酶的科学家阿尔伯发现连接酶的科学家科恩伯格、奥乔亚 基因工程美国生物化学家、现代基因工程的创始人美国生物化学家、现代基因工程的创始人P伯格伯

2、格首次实现两种不同生物的首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组体外连接，获得了第一批重组DNA分子分子,这标志着基因工程技术的诞生。这标志着基因工程技术的诞生。 7基因工程 首次实现重组的首次实现重组的dna分子在受体细胞表达分子在受体细胞表达8基因工程一、基因工程的含义一、基因工程的含义 按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善，创性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型，或者利用造出

3、更符合人们需求的新的生物类型，或者利用这种技术对人类疾病进行基因治疗，这就是基因这种技术对人类疾病进行基因治疗，这就是基因工程。工程。9 二、基因工程研究的理论依据二、基因工程研究的理论依据 不同基因具有相同的物质基础不同基因具有相同的物质基础 基因是可切割的基因是可切割的 基因是可转移的基因是可转移的 多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的遗传密码是通用的 基因可以通过复制将遗传信息传递给下一代基因可以通过复制将遗传信息传递给下一代 10基因工程三、基因工程过程操作的基本路线三、基因工程过程操作的基本路线11基因工程四、基因工程操作的工具四、基因工程操作的工具

4、 将目的基因片断从人体细胞内提取，将目的基因片断从人体细胞内提取，需要基因的剪刀需要基因的剪刀限制性内切酶。限制性内切酶。 将目的基因与运载体将目的基因与运载体DNADNA连接，连接，需要基因的针线需要基因的针线DNADNA连接酶。连接酶。 将目的基因运入大肠杆菌，将目的基因运入大肠杆菌，需要基因的运输工具需要基因的运输工具运载体。运载体。12基因工程1 1、限制性内切酶、限制性内切酶 分布：分布：主要在微生物中。主要在微生物中。 特点：特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点。切割特定切点。 结果：结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。产生黏性未端（碱基

5、互补配对）。 举例：举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。 13一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将序列，并在特定的切割点上将DNA DNA 分子切断。分子切断。目前已发现的限制酶有目前已发现的限制酶有200200多种。多种。基因工程 命名：命名：HindIII由由Haemophilus influenzae Rd中属名的中属名的H,种名的种名的in 和和菌株代号的菌株代号的d组成组成, III表示从此菌株中表示从此菌株中提取的第三种限制

6、性内切核酸酶。提取的第三种限制性内切核酸酶。14基因工程限制性内切酶作用过程限制性内切酶作用过程15基因工程几种限制性内切酶几种限制性内切酶162、DNA连接酶连接酶连接酶的作用连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的端连接起来，使之成为一个完整的DNADNA分分子。子。连接的部位：连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。磷酸二酯键，不是氢键。17基因工程DNA连接酶的作用过程连接酶的作用过程18基因工程DNA连接酶的作用过程连接酶的作用过程19DNA连接酶的作用原理连接酶的作用原理20基因工程3、运载体、运载体 作用：作用：将外源基因送入受体细胞。将

7、外源基因送入受体细胞。 条件：条件：能在宿主细胞内复制并稳定地保存。能在宿主细胞内复制并稳定地保存。具有多个限制酶切点。具有多个限制酶切点。具有某些标记基因具有某些标记基因 种类种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒、噬菌体和动植物病毒。21基因工程质粒的特点质粒的特点细胞染色体外能自主复制的小型环状细胞染色体外能自主复制的小型环状DNADNA分子；分子；质粒是基因工程中最常用的运载体；质粒是基因工程中最常用的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的存在对宿主细胞无影响；

8、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。22基因工程常用的质粒（用于原核生物）常用的质粒（用于原核生物）23 基因工程质质 粒粒24基因工程2.用于原核细胞用于原核细胞噬菌体噬菌体噬菌体：噬菌体：大小约大小约49kb，具有粘性末端，进入细胞后，具有粘性末端，进入细胞后变成环状变成环状易于感染而进入细胞易于感染而进入细胞通过裂解途径和溶源途径增值。通过裂解途径和溶源途径增值。转化转化DNA片段长，能包装片段长，能包装3854kb，能转，能转化化520kb外源基因外源基因限制性内切酶位点多限制性内切酶位点多25基因工程用于植物宿主的载体用于植物宿主的载体 Ti质粒质粒26基

9、因工程植物基因转化方法植物基因转化方法农杆菌法农杆菌法植物细胞的全能性植物细胞的全能性筛选用于动物宿主的载体用于动物宿主的载体杆状病毒杆状病毒SV40其它其它28基因工程五、基因操作的基本步骤五、基因操作的基本步骤29 提取目的基因 目的基因与运载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和表达基因工程提取目的基因提取目的基因将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。30 目前被较广目前被较广泛提取使用的目的泛提取使用的目的基因有：苏云金杆基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏素基因、种子贮藏蛋白

10、基因、植物抗蛋白基因、植物抗病基因等。病基因等。基因工程提取目的基因的方法（一）提取目的基因的方法（一）直接分离基因直接分离基因鸟枪法鸟枪法31 将供体生物的将供体生物的DNADNA用限制酶用限制酶切割为许多片段，再用运载体切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功得以表达，基因工程就算成功了。了。该法最大的缺点是带有很该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基率低。且不能

11、将真核生物的基因转移到原核生物中去。因转移到原核生物中去。基因工程从原核基因组中制备从原核基因组中制备原核基因组相对较小，用几种限制性内切酶原核基因组相对较小，用几种限制性内切酶分别消化原核基因组，其中有些片段就会含分别消化原核基因组，其中有些片段就会含有目的基因，将这些片段插入载体中进行克有目的基因，将这些片段插入载体中进行克隆，经过筛选，可以得到所需的目的基因。隆，经过筛选，可以得到所需的目的基因。基因工程从真核基因组中制备从真核基因组中制备 真核基因组比较大，直接用限制性内切酶消真核基因组比较大，直接用限制性内切酶消化后需要筛选的克隆数太多，不易操作。可化后需要筛选的克隆数太多，不易操作

12、。可以用一种限制性内切酶先消化基因组以用一种限制性内切酶先消化基因组DNA，产生连续的产生连续的DNA片段，然后电泳分离这些片段，然后电泳分离这些DNA片段，再用一段特异探针与这些片段，再用一段特异探针与这些DNA片片段进行杂交，在含有特异性模板的区域就会段进行杂交，在含有特异性模板的区域就会出现杂交带，可以初步鉴定基因组中是否含出现杂交带，可以初步鉴定基因组中是否含有目的基因。有目的基因。 基因工程基本做法是：基本做法是：待测待测DNADNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切待测待测DNADNA样品的电泳分离：样品的电泳分离： （琼脂糖凝胶电泳）（琼脂糖凝胶电泳）凝胶中凝胶中DNADNA的变性

13、：碱变性的变性：碱变性转膜：转膜： 将凝胶上的将凝胶上的DNADNA片段片段( (单链单链) )转移到转移到硝酸纤维素膜上硝酸纤维素膜上DNADNA进行杂交：进行杂交： 含放射性同位素标记的目的含放射性同位素标记的目的DNADNA片片段（单链）的探针与硝酸纤维素段（单链）的探针与硝酸纤维素膜上的膜上的DNADNA进行杂交；进行杂交；杂交结果的检测杂交结果的检测将将X X光底片压在硝酸纤维素膜光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光，将上，在暗处使底片感光，将X X光光底片冲洗，如果在底片上出现黑底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带（杂交带），则表明该色条带（杂交带），则表明该DNADNA上有目

14、的基因。上有目的基因。（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交同探针同源杂交的基因的基因DNA片片段段X光底片光底片 核酸电泳技术核酸电泳技术1 1、电泳：在外加电场的作用下，带电荷分子定向移动。、电泳：在外加电场的作用下，带电荷分子定向移动。2 2、不同的、不同的DNADNA片段被分开的原因片段被分开的原因 在一定的在一定的PHPH条件下，条件下，DNADNA带负电荷，在外加电场的带负电荷，在外加电场的 作用下，定向向正极移动，所带电荷不同，分子大作用下，定向向正极移动，所带电荷不同，分子大 小不同，移动的速度不同。小不

15、同，移动的速度不同。基因工程操作过程：操作过程：1 1）用琼脂糖制备胶板；）用琼脂糖制备胶板； 2 2）加样电泳）加样电泳( (加入荧光染料加入荧光染料) )3)3)被分离的被分离的DNADNA片段的观片段的观察察 荧光在电泳过程中会与荧光在电泳过程中会与DNADNA一起移动，并嵌入到一起移动，并嵌入到DNADNA碱基对中。在紫外灯碱基对中。在紫外灯照射下，可用肉眼看到照射下，可用肉眼看到绿色荧光。绿色荧光。基因工程 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称

16、为基因文库种生物的不同基因，称为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1 1、基因文库、基因文库提取目的基因的方法（二）提取目的基因的方法（二）基因工程基因工程基因工程是一种在体外利用酶促反应进行的是一种在体外利用酶促反应进行的DNA的快速的快速扩增技术。（本质：扩增技术。（本质：DNA的体外复制）的体外复制）聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）：）：PCR的反应体系：的反应体系：模板模板DNADNA、引物、引物、4 4种种dNTPdNTP（脱氧核苷酸）、（脱氧核苷酸）、Taq DNATaq DNA聚合酶、含聚合酶、含Mg2+Mg2

17、+的缓冲液。的缓冲液。提取目的基因的方法（二）提取目的基因的方法（二）基因工程PCR扩增仪PCR的基本反应步骤及原理的基本反应步骤及原理（1）变性变性，加热至，加热至95 ，使模板，使模板DNA解开成单链；解开成单链；（2）退火退火，温度降至适宜（，温度降至适宜（60 ），使引物与模板互补结合；），使引物与模板互补结合；（3）延伸延伸，温度升至，温度升至72 ，DNA聚合酶以聚合酶以4种种dNTP为底物，为底物， 合成与模板互补的合成与模板互补的DNA新链。新链。基因工程 如已知目的基因两端的序列，如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（则可采用聚合酶链反应（PCRPCR）技术，在体外

18、合成目的基因）技术，在体外合成目的基因。利用。利用PCRPCR获取目的基因的一获取目的基因的一大优点就是可以根据需要在引大优点就是可以根据需要在引物序列上设计适当的酶切位点物序列上设计适当的酶切位点、起始密码子或终止密码子等、起始密码子或终止密码子等，或通过人为错配改变碱基序，或通过人为错配改变碱基序列（人工突变）对目的基因进列（人工突变）对目的基因进行有限修饰。行有限修饰。 利用利用PCR合成目的基因合成目的基因43 直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使推算出信使RNARNA核苷酸顺序，再据此推算核苷酸顺序，再据此推算出基因出基因DNADNA的脱氧核

19、苷酸顺序。用游离脱的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。氧核苷酸直接合成相应的基因。 逆转录法：以信使逆转录法：以信使RNARNA为模板，在逆转录为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(DNA(基因基因) )。DNA合成仪基因工程提取目的基因的方法（四）提取目的基因的方法（四）基因工程1、直接合成法2 2、逆转录法：、逆转录法： 采用一定的方法获取特定基因采用一定的方法获取特定基因的的mRNA，再通过逆转录酶催化合成，再通过逆转录酶催化合成其互补其互补DNA（单链单链），除去），除去RNA链链后，再用后，再用DNA聚合酶合成其互补聚合

20、酶合成其互补DNA链，从而得到双链链，从而得到双链DNA。基因工程二、目的基因与运载体结合二、目的基因与运载体结合 用与提取目的基因相同用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用对后，在连拉酶的作用下连接形成重组下连接形成重组DNADNA分子。分子。46基因工程目的基因与质粒的连接目的基因与质粒的连接47基因工程三、将目的基因导入受体细胞并扩增三、将目的基因导入受体细胞并扩增 基因工程中常用的受体细

21、胞有大肠杆基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。细胞等。 导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。一些受体细胞进行增大通透性的处理。 目的基因可以随着受体细胞进行快速的目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。因。48基因工程1、重组、重组DNA导入受体细胞的途径导入受体细胞的途径（一）化学转染法（一）化学转染法 化学转染法包括化学转染法包括DE

22、AEDEAE一葡聚糖法、磷酸钙法一葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法等。和人工脂质体法等。目前应用最广泛的是人工目前应用最广泛的是人工质体法。质体法。 1.DEAE-1.DEAE-葡聚糖葡聚糖 是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-DEAE-葡聚糖是阳离子多聚葡聚糖是阳离子多聚, ,它与带负电的核酸它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。结合后接近细胞膜而被摄取。DEAEDEAE一葡聚糖转一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。却不可靠。49基因工程 2. 2.磷酸钙法即磷酸钙共沉淀转染

23、法磷酸钙法即磷酸钙共沉淀转染法 由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将时转染和稳定染的研究。方法是，先将DNADNA和和氯化钙混合，然后加人到氯化钙混合，然后加人到PBSPBS中慢慢形成中慢慢形成DNADNA磷磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人DNADNA。50基因工程 3.3.人工脂质体法具有较高的转染效率人工脂质体法具有较高的转染效率 不但可以转染其它化学方法不易转染的细不但可以转染其它化学方法不易转染的细胞系，而且

24、转染从寡核着酸到人工酵母染色体胞系，而且转染从寡核着酸到人工酵母染色体不同长度的不同长度的DNADNA，以及，以及RNARNA和蛋白质。此外，脂和蛋白质。此外，脂质体体外染还适用于瞬时表达和稳定表达。与质体体外染还适用于瞬时表达和稳定表达。与其它方法不同的是，脂质体还可以介导其它方法不同的是，脂质体还可以介导DNADNA和和RNARNA转动物和人的体内，用于基因治疗。人工转动物和人的体内，用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体与带负电荷的核酸结合后合成的阳离子脂质体与带负电荷的核酸结合后形成合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为形成合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后内体进入细

25、胞质，随后DNADNA复合物被释放进入复合物被释放进入细胞核内。至于细胞核内。至于DNADNA是如何穿过核膜的目前还是如何穿过核膜的目前还不十分清楚。不十分清楚。51基因工程 （二）物理方法（二）物理方法包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。1.1.电穿孔法（电穿孔法（eleetroPorationeleetroPoration） 常用来转染如植物原生质体等常规方法不容易转常用来转染如植物原生质体等常规方法不容易转染的细胞。关于电穿孔技术用于基因导人的报道始见染的细胞。关于电穿孔技术用于基因导人的报道始见于于19821982年（年（WhngWhng等）。其作用

26、原理是，利用高压电脉等）。其作用原理是，利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。 52基因工程 2. 2.显微注射法显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的该法虽然费

27、力，但却是非常有效的将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种将核酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但不适用方法常用来制备转基因动物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。于需要大量转染细胞的研究。 3.3.基因枪法基因枪法 该法依靠携带了核酸的高速粒子而该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。养的细胞和在体的细胞。 53基因工程54基因工程显微注射法显微注射法转基因植株基因枪法基因枪法56基因工程基因枪基因枪（三）病毒感染（三）病毒感染 病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统，病毒颗粒是一类十分有效的基因

28、释放系统，因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有一定的病毒操作经验和良好的设施。病毒表达一定的病毒操作经验和良好的设施。病毒表达系统内容十分丰富，其应用已越来越广泛。系统内容十分丰富，其应用已越来越广泛。57基因工程为什么选用大肠杆菌做受体细胞为什么选用大肠杆菌做受体细胞581、培养简单、繁殖迅速2、基因组小，遗传背

29、景简单3、没有核膜4、研究透彻基因工程为什么现在又要选择其他的受为什么现在又要选择其他的受体细胞呢体细胞呢大肠杆菌会产生内毒素大肠杆菌会产生内毒素难于把产物分泌到细胞外难于把产物分泌到细胞外59基因工程目前比较好的替代品目前比较好的替代品 枯草杆菌：非致病性枯草杆菌：非致病性 不产生内毒素不产生内毒素 能把产物分泌到细胞外能把产物分泌到细胞外 酵母：毒性更小酵母：毒性更小 能把产物分泌到细胞外能把产物分泌到细胞外 60基因工程四、目的基因的检测和表达四、目的基因的检测和表达 前三步的处理十分繁锁，为保证目前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的的基因得到有效利用，通常用大

30、量的受体细胞来接受不多的目的基因。这受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出的基因的很少，必须将它从中检测出来。来。61基因工程（1）根据载体表型特征选择重组体分子的）根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法直接选择法在基因工程中使用的所有的载体分子，在基因工程中使用的所有的载体分子，都带有一个可选择遗传标记或表型特征。都带有一个可选择遗传标记或表型特征。遗传选择法使我们能够将重组体的遗传选择法使我们能够将重组体的DNA分分子同非重组体的亲本载体分子区别开来。子同非重组体的亲本载体分子区别开来。（i）抗药

31、性记号插入失活选择法）抗药性记号插入失活选择法pBR322质粒具有编码有四环素抗性基质粒具有编码有四环素抗性基因（因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因）和氨苄青霉素抗性基因（ampr），只要将转化的细胞培养在含有），只要将转化的细胞培养在含有四环素或氨苄青霉素的生长培养基中，便四环素或氨苄青霉素的生长培养基中，便可以容易地检测出获得此种质粒的转化子可以容易地检测出获得此种质粒的转化子细胞。细胞。621遗传检测法 基因工程63（2）-半乳糖苷酸显色反应选择法半乳糖苷酸显色反应选择法根据插入失活原理，将外源根据插入失活原理，将外源DNA插入到插入到它的它的lacZ基因上所造成基因上所造成-半乳糠苷酶

32、失活效半乳糠苷酶失活效应，可以通过大肠杆菌转化子菌落在应，可以通过大肠杆菌转化子菌落在Xgal-IPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。培养基中的颜色变化直接观察出来。-半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。 64基因工程656667（3）根据插入序列的表型特征选择重组体）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法分子的直接选择法这种选择法依据的基本原理是，转化这种选择法依据的基本原理是，转化进来的外源进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从

33、而使被转化的寄主细胞表或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。现出外源基因编码的表型特征。 68基因工程69 细菌的检测，将每个受体细胞单独细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研落，保留有表达产物的进一步培养、研究。究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物基因工程 二物理检测法二物理检测法 （1）凝胶电泳检测法）凝胶电泳检测法质粒质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小

34、的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的。因此，那些带有外源成比例的。因此，那些带有外源DNA插入序插入序列的分子量较大的重组体列的分子量较大的重组体DNA，在凝胶中的，在凝胶中的迁移速度，就要比不具有外源迁移速度，就要比不具有外源DNA插入序列插入序列的分子量较小的质粒的分子量较小的质粒DNA来得缓慢些根据这来得缓慢些根据这种差别，就可以容易地鉴定出哪些菌落是含种差别，就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有具外源有具外源NDA插入序列的分子量较大的重组插入序列的分子量较大的重组质粒。质粒。70基因工程71基因工程（2）R-环检测法环检测法在临近双链在临近双链DNA变性温度下和高浓度变性温度下和高浓度（

35、70%）的甲酰胺溶液中，即所谓的形成）的甲酰胺溶液中，即所谓的形成R-环环的条件下，双链的的条件下，双链的DNA-RNA分子要比双链的分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将分子更为稳定。因此，将RNA及及DNA的混合物置于这种退火条件下，的混合物置于这种退火条件下，RNA便会同它便会同它的双链的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而使被取代的另一链处于杂交分子，而使被取代的另一链处于单链状态。这种由单链单链状态。这种由单链DNA分支和双链分支和双链DNA-RNA分支形成的分支形成的“泡状泡状”体，叫做体，叫做R-环结构。环结

36、构。R-环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子显微锐下观察到。所以，应用显微锐下观察到。所以，应用R-环检测法，可环检测法，可以鉴定出双链以鉴定出双链DNA中存在的与特定中存在的与特定RNA分子同分子同源的区域。源的区域。 72基因工程73三菌落或噬菌斑杂交筛选法三菌落或噬菌斑杂交筛选法 将被筛选的大肠杆菌菌落，从其生长的琼脂平板中将被筛选的大肠杆菌菌落，从其生长的琼脂平板中小心地转移到铺放在琼脂平板表同的硝酸纤维素滤小心地转移到铺放在琼脂平板表同的硝酸纤维素滤膜上，而后进行适当的温育。取出已经长有菌落的膜上，而后进行适当的温育。取出已经长有菌落的硝酸

37、纤维素滤膜，使用碱液处理，使硝酸纤维素滤膜，使用碱液处理，使 DNA变性。然变性。然后再用适当的办法处理滤膜以除去蛋白质，留下的后再用适当的办法处理滤膜以除去蛋白质，留下的便是同硝酸纤维素滤膜结合的变性便是同硝酸纤维素滤膜结合的变性DNA。变性。变性DNA同同硝酸纤维素滤膜有很强的亲全力，这样便形成了菌硝酸纤维素滤膜有很强的亲全力，这样便形成了菌落的落的“DNA印迹印迹”。在。在80下烘烤滤膜，以使下烘烤滤膜，以使DNA牢固牢固地固定下来。将这些滤膜同放射性标记的地固定下来。将这些滤膜同放射性标记的DNA或或RNA探针杂交，并通过放射自显影检测杂交的结果。含探针杂交，并通过放射自显影检测杂交的

38、结果。含有同探针互补的有同探针互补的DNA的菌落，在的菌落，在X光底片上呈现黑色光底片上呈现黑色的斑点通过同原培养基平板上菌落位置的对照，挑的斑点通过同原培养基平板上菌落位置的对照，挑选出阳性菌落，便是我们所需要的含有目的基因插选出阳性菌落，便是我们所需要的含有目的基因插入片段的重组体克隆。入片段的重组体克隆。74基因工程75基因工程 多细胞生物的检测，多细胞生物的检测，将每个受体将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。步培养、研究。76例：用棉铃饲喂棉铃例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基