2018微生物检验技术师考点(共45页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上 1.仪器的标识管理：红（停用）黄（准用）绿（合格）各自所表明的状态。2.分光光度计检测细菌浓度用可见光分光光度计，测细菌波长用。检测蛋白用紫外分光光度计（波长用），它也可测核酸浓度（波长）。选定分光光度计测定颜色反应光的波长是。石英比色皿用于紫外分光光度计，玻璃比色皿用于可见光分光光度计。 3紫外透射仪 该仪器使用条件是暗室和紫外线，主要用于在紫外线下看条带。 4色谱气相色谱可做微生物分类和鉴定，用于微生物的化学成分分析。液相色谱仪也可做微生物化学成分分析。质谱仪也可做微生物化学成分分析。 5测序仪蛋白测序仪测定氨基酸排列顺序，测序仪是测核苷酸排列顺序。能做测序的物

2、质是质粒、噬菌体、产物。 6扩增仪 是聚合酶链反应缩写，能做称扩增仪。它能以一定片段为模板，变换温度，扩增该片段。常用的“枪”是实验室常用的微量可调移液器。 7酶标做的仪器称酶标仪，做反应，其中主要设备有塑料凹孔板、洗板机和酶标仪。8.电泳类别 醋酸纤维膜电泳可用于免疫球蛋白鉴定，琼脂免疫电泳用于蛋白分离和鉴定，对流免疫电泳可测抗原或抗体，火箭电泳测抗原量，交叉定量免疫电泳测抗原量。是等电聚焦电泳。是脉冲电场凝胶电泳，是聚丙烯酰胺凝胶电泳。9. 用于蛋白和核酸分离，原理是凝胶介质形成立体多孔网状结构，具有分子筛和电泳作用。分离条带上边是大分子，下边是小分子物质。过硫酸铵在制备起催化聚合作用。是

3、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，它用于蛋白分离，在此电泳中，丙烯酰胺浓度越大，线性分离范围越小；该物浓度越小，线性分离范围越大，十二烷基硫酸钠作用是解离蛋白，用标准蛋白做标识测验电泳条带分子量。在中常用蛋白染料是考马斯亮蓝，硝酸银也是其常用染料。该电泳中缓冲液重要成分为甘氨酸。 10、等电聚焦电泳 其原理是以两性电解质制造凝胶有不同，使带不同电荷的多肽在电泳条件下于等电点停留。 两性电解质是制备该电泳凝胶不同重要物质，用聚丙烯酰胺制备等电聚焦电泳凝胶。这种电泳主要用于蛋白质分离。 11、脉冲电泳 脉冲电泳用于核酸分离，其优点是分离大片段核酸。用琼脂糖制备该电泳凝胶的介质。这种电泳的电场为正交

4、的交变脉冲电场。脉冲电场凝胶电泳条带靠近负极为大片段，靠近正极为小片段。染色可用溴化乙锭，也可用硝酸银。因溴化乙锭有致癌作用，故在使用时应注意。丙烯酰胺具有神经毒，在用时注意个人防护。 12、琼脂糖凝胶电泳 此电泳用于核酸分离与纯化，用水平电泳槽。分离片段最佳范围为。13、聚丙烯酰胺电泳 该电泳通常用垂直电泳槽，分离片段是最佳范围是。 14.中华人民共和国国家标准GB 19489-2004实验室生物安全通用要求根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级： 危害等级（低个体危害，低群体危害）不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。 危害等级（中等个体危害，有限群体危

5、害）能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。 危害等级（高个体危害，低群体危害）能引起人或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能用抗生素抗寄生虫药治疗的病原体。 危害等级（高个体危害，高群体危害）能引起人或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接、间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物之间传播的病原体。15.保存的病原微生物菌（毒）种要按规定进行登记、上报和核准，实行双人双锁管理和使用审批制度。 保存和使用各类病原微生

6、物菌（毒）种的实验室，应具备相应的实验室设备和设施条件，并在二级以上生物安全柜中操作。细菌实验室在污染情况超过许可程度时，通常采取甲醛熏蒸消毒。病毒篇 1.用于病毒分离的材料，无论是传代病毒培养物，还是采自发病或死亡动物的病料，都应尽快送往实验室作病毒分离或鉴定。组织细胞或动物接种和传代可以应用于病毒的分离和鉴定。病毒对细胞的感染性具严格的选择性和特异性，因此用组织培养细胞接种病毒必须首先选择敏感细胞。 （1）病毒增殖的判定：病毒在实验动物体和组织培养细胞内增殖，显然都会影响机体和细胞的代谢和生命活动，并且经常通过一定的形态学和病理学变化表现出来。 （2）细胞病变（CPE）：大部分病毒在敏感细

7、胞系均可出现CPE，CPE可以表现为严重的细胞破坏、细胞肿大、颗粒增多、细胞融合成合胞体或无明显的细胞变化等。CPE经常具有病毒“种”的特性，因此常常作为病毒鉴定的依据之一。（3）病毒蚀斑（又称空斑）技术：病毒蚀斑是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的纯化或病毒悬液中感染病毒含量的测定。（4）病毒感染力的滴定：常用的病毒感染力的滴定有两种方法，一种方法是用实验动物测定LD50（半数致死量），另一种方法是在组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量）。（5）病毒的保存：分离或鉴定后的病毒经过冷冻干燥后可以长期保存。 2病毒形态学检查 快速有效的标本制作技术故然重要，但

8、更需要识别病毒结构的经验。病毒形态学检查方法主要有： （1）光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。 （2）电子显微镜检查法 （3）超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。 （4）超速离心法 根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。 （5）X线晶体衍射法 但标本必须为结晶，可用于无包膜病毒的研究。3免疫学鉴定 4病毒的分子生物学鉴定 分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性，病毒的分子生物学鉴定，包括对病毒

9、核酸和蛋白质的测定。 核酸测定主要使用聚合酶链反应技术、探针技术和核酸序列测定，检测病毒基因组中的特征性区段甚至整个病毒基因组；而蛋白质测定可使用免疫测定技术、电泳技术和质谱技术，检测病毒特异的蛋白质成分。 实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞都可以作为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。 1组织培养 组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用硫酸和重酪酸钾溶液浸泡后再清洗应用。 常用的人工综合营养液为MEM和RPMI1640。用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，

10、加人碳酸氢钠溶液修正pH，根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的pH缓冲能力。能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可称之为Versen溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，且有很强的酸碱缓冲能力。细胞培养液在细胞培养过程中可分为细胞生长液和细胞维持液两种。生长液是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；维持液用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。细胞生长适宜的pH范围是p

11、H7.27.6。细胞培养技术全过程的关键是防止污染。2细胞株的保存 二甲基亚砜是细胞低温保存的良好的保护剂，含10二甲基亚砜的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞。 3. 病毒学上常用的细胞类型可分为原代细胞、二倍体细胞和传代细胞三大类，原代细胞培养和传代细胞培养的根本区别在于细胞是否能在体外无限传代。 4. 细胞的纯化 细胞的纯化可以用细胞克隆技术。克隆是指用无性繁殖方法产生的一组遗传上相同的细胞和生物群体的过程。 分子杂交，常规的细菌筛选和各种杂交时多选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。 （1）Southern杂交 被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。 （2）Northern杂交

12、被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。 PCR (聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 1、 引物 引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最

13、好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸 的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子 克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好。 2、 酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生

14、杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 3、 dNTP dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L， 4、模板 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS

15、还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止Rnase降解RNA。5、Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非

16、特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 基因芯片也称为基因微阵列技术，指采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的靶基因或寡核苷酸片段固化于支持物表面上，产生探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过监测杂交信号来实现对生物样品进行快速、并行、高效检测或医学诊断。基因微阵列技术主要包括四个基本技术环节：芯片微阵列制备、样品的准备和标记、生物分子反应和信号的检测及数据分析处理。 虽然基因芯片技术在微生物诊断中存在一定的不足，但还存在很大的应用前景，其在微生物诊断中，具有以下优越性：1）高通量，可以同时对多种微生物进行监控。2）多条探针的分子

17、杂交，可以有效的克服PCR易被污染的特点，从而提高了特异性。3）可以克服窗口期漏检情况的发生。特别是将其应用于对几种微生物的多重感染的诊断上，和鉴定新的病原微生物上，如在SARS病毒的鉴定中发挥了很大的作用。   一、DNA的复制和修复 细胞每分裂一次，染色体DNA就合成一次。DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新单链，成为半保留复制。在体内DNA复制时必须有RNA引物。 二、转录 在生物体内，DNA指导的RNA合成过程称为转录。它是按照储存在DNA上遗传信息合成。合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 三、翻译 在合成各种不同RNA中

18、，tRNA具有搬运氨基酸功能。构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。4种核苷酸排列组成遗传信息，合成蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序，遗传信息的这种转换称为翻译。3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA三个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。原核生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成。在真核生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上

19、，并切割双链DNA。它可分为三类，其中类限制性内切酶在分子克隆和微生物鉴定中得到了广泛应用。绝大多数类限制酶识别长度为4或6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。DNA经限制性内切酶切割后产生许多一定长度的片段，使用电泳的方法分离不同长度的片段，一种DNA结构就能形成一种特征性的图形，称为DNA的电泳图谱。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差lbp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶通常采用垂直装置进行电泳

20、。 电泳完毕后，使用溴化乙啶染色，DNA片段聚集的地方，在紫外光下可以显示发橙色荧光的条带。如果电泳中使用了已知大小的DNA片段作为分子量标志，可以测量并计算出每一DNA片段的长度。结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析将这些片段排列起来，便可作出DNA的限制性内切酶酶切图谱。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。 分子生物学基本技术知识点质粒DNA的分离、纯化和鉴定 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和

21、真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如致病的能力和对抗生素的抗性等。 细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 抗体检测知识点抗体检测方法 （1） 中和反应 中和反应不仅测定抗体是否存在，而且测定抗体是否具有免疫保护作用，因而，尽管这种方法复杂费时，影响因素众多而且不稳定，在预防医学领域特别是病毒性疾病中，仍然是不可取代的抗体检测方法。 中和试验的基本方法是，将待检物质与活的致病微生物混合，感染实

22、验动物或敏感的细胞，然后观察实验动物是否发病、死亡，或细胞是否发生病变。在结果的解释中应当注意，细胞的中和试验通常只反应抗体阻断病毒进入细胞的能力，这只是病毒致病过程中的一小部分。 （2） 沉淀反应 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物，这类反应称为沉淀反应。该类反应可检测到202mgml水平的抗体。较常用的检测方法有：1.单向免疫扩散 将一定量已知抗原混于琼脂中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗体加入孔中扩散，抗原抗体在扩散过程中形成以抗体孔为中心的沉淀环，可用于检测血清中的IgG、IgM、IgA和补体C3等的含量。 2双向免疫扩散 将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶

23、中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。可用于抗体的定性、定量检测。 （三）凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应。 1直接凝集 将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌或红细胞凝集现象。检测方法有两种：一是玻片凝集试验，用于定性测抗原，多用于快速诊断；二是试管凝集试验，在试管种系列稀释待检血清，加入已知颗粒抗原（死菌或活菌，多用死菌），进行的血清反应，用于定量检测抗体。温箱中放24小时后取出反应管在室温放2个小时再判断为宜，判定凝集滴度以凝集程度为+而定。 2间接凝集 将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表明，与相应抗体反应出现颗粒凝集的

24、现象。（四）补体参加的反应 利用抗体与红细胞上的抗原结合，激活反应体系中的补体，导致红细胞的溶解，用溶血现象作为指示系统帮助结果判定。常用的方法有补体结合试验和溶血空斑试验。（五）用标记抗原进行的抗原抗体反应 利用荧光素、酶或放射性核素等标记物标记抗原或抗体，进行的抗原抗体反应。灵敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等优点。 1免疫荧光 将已知细菌、感染病毒的细胞等颗粒抗原等固定于载玻片，加待检血清反应后，再 加荧光素标记的抗抗体，置荧光显微镜下观察判定，用于检测抗体。 2 酶免疫测定 是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。可用目测定性，也可用酶标测定仪测定光 密度（OD）值以反应抗体的含量，敏

25、感度可达ngml甚至pgml。常用于标记的酶有辣 根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。常用的方法有酶联免疫吸附试验（EUSA）。采用双抗体 夹心法或间接法检测特异抗体。 3 放射免疫测定法 用放射性的核素（125I和131I）标记抗原，检测抗体，灵敏度达pgml。 4 免疫印迹法 将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳区分的蛋白质抗原转移置NC或PVDF等膜 上。检测特异的抗体。用该法检测血清HIV抗体为诊断HIV感染的方法之一。 细胞免疫检验知识点淋巴细胞的分离与类型鉴定 体外检测淋巴细胞，需要先制备外周血单个核细胞（PBMc），制备PBMC常用的方法是葡聚糖一泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。以

26、下方法通过检测淋巴细胞的某些表面标志，可确定细胞的不同类型。 1免疫荧光法 2磁珠分离法 3陶选法 4流式细胞术 细胞免疫检验知识点免疫细胞功能测定 （1） T细胞功能测定 1T细胞增殖试验 2细胞毒试验 （1）51Cr释放法 （2）乳酸脱氢酶释放法（3）皮肤试验：根据局部红肿为特征的迟发型超敏反应的强度检测。常用的生物性抗原常从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素等。 （二）B细胞功能测定 1B细胞增殖试验 B细胞受丝裂原刺激后，进行分裂增殖，温育一定时间后检查抗体形成细胞的数目。 2抗体形成细胞测定 常用的溶血空斑试验测定。将SRBC、待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾斜平皿，温育l3小

27、时后，肉眼观测分散的溶血空斑出现，每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑的数量即为抗体形成细胞数。 常用仪器知识点生物培养类 1 普通培养箱 分为隔水式和直热式两种，隔水式培养箱采用浸入式电热管隔水加温，箱内各部温度恒定均匀，为实验室首选；直热式培养箱是以电炉丝直接加热，箱内上下层温度相差较大，指示用温度计不能真实指示底层温度。 用途：用于普通需氧和兼性厌氧细菌的培养。当室温低时，也可用于真菌培养。但细菌和真菌不可在同一培养箱内培养。使用时注意事项：（1） 箱体必须有效接地，避免将水溅在内层玻璃门上，以防玻璃受骤冷而爆裂。 （2） 隔水式培养箱在通电前，一定要先加水（以蒸馏水或去离子水为宜），否

28、则会烧坏电热管，经常观察水位指示浮标，水位不足时，及时补足水量。 （3） 箱内的培养物不宜放置过挤以利冷热空气对流不受阻塞，保持箱内温度均匀。培养时，打开箱体顶部的通风口，避免箱内湿度过大。 （4） 如箱内温度不稳定，可检查温度控制器的接点或请专人检修。 （5）使用时应早晚观测箱内温度各一次，每次观测后记录箱内实际温度。 （5） 培养箱使用后要定期消毒，以免交叉污染，影响检测结果。 2真菌培养箱 是气温过高地区培养霉菌和酵母菌的必备设备。配有加热、制冷、加湿、消毒系统，可自动调节温度，控制湿度、定时消毒、自动换气等。当室温高于35时，也可用于培养细菌。但真菌和细菌不可在同一培养箱内培养。 使用

29、时注意事项：（1） 接通电源后，打开开关，设定温度，并用测量开关测量箱内实际温度。 （2） 开机一段时间后加热和制冷两灯均不亮，表示箱内温度达到平衡；如两灯同时亮，表示机器故障，须请专业人员检修。 （3） 在箱内取放物品时，切勿碰撞探头，以免影响灵敏度。 （4） 在制冷装置启动时，如有异常声音，应立即停机检修。 （5） 仪器使用时应每天两次（早、晚各一次）观测记录箱内实际温度，并由使用人和保管人签字。 （6） 每批培养物培养后，要定期对培养箱内进行消毒，以免交叉污染。 3.恒温振荡培养箱 需恒温振荡培养的微生物可用此培养箱培养。其内部有冷、热气流风道使箱内气体循环流畅，温度比较均匀。实验室应根

30、据需要选择相应温度范围和振荡频率的培养箱使用。使用时注意事项：（1）设备要求工作地面平整且后部有散热空间，切勿冲击散热片。（2）设备移动时要平行移动，任一方向不可倾斜大于45度。 （3）摇盘上的螺钉要经常检查，以免所夹物品脱落。 （4）如长期工作在“制冷”状态时或停机三个月以上，要按期做加热驱潮处理，每隔两周一次。 （5）使用中定时观测箱内温度和转速，并做记录。 （6）如发生故障，应由专业人员检修。 4厌氧（CO2）培养箱 主要用于厌氧菌、微需氧菌等的培养。一般由控温、抽空、细菌过滤、细菌培养罐以及箱外的各种压缩气体钢瓶组成。 使用时注意事项： （1）N2、CO2钢瓶可立于箱体旁与箱体相连，H

31、2钢瓶应另置安全处，以免发生危险，用时用橡皮袋取出少许，与上述钢瓶配用。 （2）作厌氧培养时，打开培养罐门，将已接种好的培养物放人罐内并迅速放人催化剂钯粒、干燥剂、亚甲基蓝指示剂，关闭罐门并扭紧。 （3）打开此罐的电磁阀开关和真空泵开关，抽气至真空度达到93.3kPa时，关闭 真空泵开关。 （4）开启N2输气阀，慢慢开启N2钢瓶和减压阀，使罐内充满N2气，关闭N2气，开启真空泵抽气，然后再用N2充气一次。 （5）第三次按N2 80、H2 10、C0210充气。待指针回至零位时关闭输气阀，再关减压阀和电磁阀。不可出现负压，影响厌氧环境。 （6）选择所需温度，进行培养。 （7）在培养过程中不可打开

32、培养罐门。以免破坏厌氧环境。 （8）使用过程中要经常观测培养箱内温度，并进行记录。 常用仪器知识点显微成像类 1.显微镜可分为普通光学显微镜和电子显微镜，实验室可根据观测项目不同选择相应的类型。利用光的衍射作用，以可见光为照明光源的普通光学显微镜的分辨极限为200nm，可观测细菌和细胞，但对于细菌和细胞的亚结构以及病毒，光镜无法辨认；电镜以电子束为照明光源，其波长极短，可有效提高其分辨率，达到0.2nm，用电磁透镜代替玻璃透镜。 2 暗视野显微镜 可分辨0.04微米的物体，微生物实验室多用于观察未染色标本活的细菌、真菌等，并可观察活细胞内的线粒体及细菌鞭毛的运动。但其只能看到物体的存在和运动，

33、不能看清其细胞结构。 载玻片厚度为1.0mm，且载玻片和盖玻片需清洁无划痕；标本浓度不宜过浓。 3 荧光显微镜 荧光显微镜是利用荧光光源（紫外光）作为激发光，透过经荧光色素染色的标本，辐射出比激发光的波长较长的荧光，经光学系统放大后，可观察其可见的荧光图像，可分辨标本内一些物质的性质与位置。 常用仪器知识点灭菌、消毒类滤菌器是利用微孔滤膜的微小孔径通过抽滤或压滤，将微生物阻留在滤膜上，以便进一步培养分析。从材质的不同可分为玻璃滤菌器和金属滤菌器等；从工作原理的不同可分为负压抽滤和正压压滤。1 超净工作台 超净工作台是微生物实验室通常使用的无菌操作台，比一般的无菌操作室更洁净其洁净度可达百级。

34、超净工作台采用层流技术净化空气，分为水平式和垂直式，在层流有效区内保持无菌环境。但不能保证微生物不污染环境和操作人员。而另加一套空气回收系统的生物安全净化工作台，可避免被检材料污染环境和操作人员。2 生物安全柜 生物安全柜可提供样品和工作人员的双重保护。过滤后的洁净气流从安全柜顶部吹下，通过工作区域，在到工作人员的呼吸区域前被俘获。气流在放空前将被过滤,一般情况下过滤后的空气将被排回实验室。超净工作台提供的是对样品的保护，对操作者和环境是不提供保护的；而生物安全柜同时提供对操作者、环境和样品的保护。 生物安全柜可分为一级、二级和三级三大类以满足不同的生物研究和防疫要求。 （1）一级生物安全柜可

35、保护工作人员和环境而不保护样品。气流原理和实验室通风橱一样，不同之处在于排气口安装有HEPA过滤器。所有类型的生物安全柜都在排气和进气口使用HEPA过滤器。一级生物安全柜本身无风机，依赖外接通风管中的风机带动气流，由于不能保护柜内样品，目前已较少使用。 （2）二级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型。按照NSF49的中的规定，二级生物安全柜依照人口气流风速、排气方式和循环方式可分为4个级别：A1，A2，B1，B2。所有的二级生物安全柜都可提供工作人员、环境和样品的保护。 （3）三级生物安全柜是为4级实验室生物安全等级而设计的，柜体完全气密，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，俗称手套箱，试验品

36、通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，适用于高风险的生物试验。生物安全柜柜内操作主要注意事项： A.缓慢移动原则：为了避免影响正常的风路状态，柜内操作时手应该尽量平缓移动。 B.物品平行摆放原则：为了避免物品和物品之间的交叉污染现象产生，在柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开，避免回风过程中造成交叉污染。同时避免堵塞背部回风隔栅影响正常风路。 C.避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器（例如离心机漩涡振荡器等）的使用，因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落。导致操作室内部洁净度降低，同时如果在前操作面平衡失败还会引起安全柜对操作者的污染。 D.不同样品柜内移动原则：柜内两种及以上物品需要移动

37、时，一定遵循低污染性物品向高污染性物品移动原则，避免污染性高的物品在移动过程中产生对柜体内部的大面积污染。E.明火使用原则：柜内尽量不要使用明火!因为在明火使用过程中产生的细小颗粒杂质将被带入滤膜区域，这些高温杂质会损伤滤膜。无法避免一定需要使用的时候，宜使用低火苗的本生灯。 F、需定时检测工作台性能，并记录检测结果，根据检测结果调整过滤器。 G、该设备应有专人保管并记录使用和检修情况。 消毒知识点干热灭菌法 干热的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。一般细菌繁殖体，在干燥状态下80100经1小时可被杀死；芽孢则需160170，2小时才能杀灭。干热灭菌机制如下：使菌体蛋白质变性；电解质浓缩引起

38、中毒。干热灭菌法包括： （1）焚烧法：用火焚烧，是一种彻底的灭菌方法，仅适用于废弃的污染物品和有传染性的动物尸体等。 （2）烧灼法：微生物操作用器材可在火焰上烧灼灭菌，但在分子生物学实验中已不主张使用。 （3）干烤法：需在干烤箱内进行，通电后利用高热空气进行灭菌。一般加热160170，维持2小时即可杀灭包括芽孢在内的一切微生物。本法灭菌物品主要限于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器等。 （4）红外线：产生热效应，但只能照到物体的表面，多用于医疗器械的灭菌。 消毒知识点湿热灭菌法 湿热灭菌法是最常用的灭菌法，效果较好。在同一温度下湿热杀菌效果优于干热，其原因有三：湿热中菌体吸收水分，蛋白质较易凝固。

39、试验表明，蛋白质含水量增加，凝固所需的温度降低；湿热比干热的穿透力好，这主要是由于水或蒸汽传导热能的效率明显高于空气；蒸汽有潜热存在。每一克水在100时，由气态变为液态可放出529卡的热量。这种潜热能迅速提高被灭菌物质的温度。 湿热杀菌机制相对复杂，主要有以下几点：使菌体蛋白质变性和凝固；使细菌核酸降解；使细菌胞浆膜损伤。常用的湿热杀菌法有： （1）煮沸法：煮沸1005分钟可杀死细菌的繁殖体，但一般消毒以煮沸10分钟为宜，杀死芽孢则需煮沸13小时。煮沸法主要用于一般外科器械、注射器、胶管和食具等的消毒。若水中加入l2碳酸氢钠，可提高沸点105，既可增强杀菌能力，又可防止金属器械生锈。 （2）流

40、动蒸汽灭菌法：又称常压蒸汽消毒法，是利用一个大气压下100的水蒸汽进行消毒，加热1530分钟可杀死细菌的繁殖体，但不保证杀死芽孢。 （3）间歇蒸汽灭菌法：是利用反复多次的流通蒸汽杀死细菌所有繁殖体和芽孢的一种灭菌法。本法适用于耐热物品，也适用于不耐热的含糖、牛奶等培养基。 （4）高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌法，灭菌的温度取决于蒸汽的压力。在一个大气压下，蒸汽的温度是100。如果蒸汽被限制在密闭的容器里，随着压力的升高，蒸汽的温度也相应的升高。在103.4kPa(1.05kgcm2)蒸汽压力下，温度达到121.3，维持1520分钟，可杀灭包括细菌芽胞在内的所有的微生物。此法

41、适用于高温和不怕潮湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术器械、注射器、手术衣、敷料和橡皮手套等耐高温、耐湿热物品的消毒。 （5）巴氏消毒法：常用于牛奶和酒类的消毒。此法可杀死物品中的病原菌或一般杂菌，而不严重破坏物品的质量。方法有两种：一种是加热61.162.830分钟；另一种是71.7经1530秒，现广泛采用后法。 消毒知识点其他物理杀菌方法 (一)辐射杀菌法 1紫外线 日晒是一种有效的天然杀菌方法，其杀菌作用主要是靠日光中的紫外线。将病人的被褥、衣服、书报等放在日光下暴晒数小时，可达到消毒之目的。一般用于消毒的人工紫外线是由低压水银蒸汽灯、紫外线灯产生的。由于紫外线穿透力较弱，不能透过

42、玻璃、纸张等物品，故只适用于空气和物品表面的消毒。紫外线对人体皮肤和眼睛角膜有一定的损伤作用，使用紫外线灯照射时应注意防护。 紫外线的杀菌作用与其波长有关，通常波长为240280nm者具有杀菌作用。其中以260nm最强。 2电离射线 电离射线具有较高的能量和穿透力，可直接或间接破坏微生物的核酸、蛋白质和酶系统，从而对其产生致死效应。用于消毒灭菌的电离射线有X射线 (二)滤过除菌法 滤过除菌是用特殊的器具将液体或空气中细菌除去的方法。所用器具是含有微细小孔的滤菌器，通常大于孔径的细菌不能通过，借以获得无菌液体或空气。主要用于不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素、药液和空气等的除菌，除菌滤器一般不能除

43、去病毒、支原体和L型细菌。 滤菌器的种类很多，目前常用的有蔡氏滤菌器、玻璃滤菌器、薄膜滤菌器。 (三)超声波杀菌法 超声波可以裂解多数的细菌，尤其是革兰阴性菌更为敏感，但往往有残存者。目前，超声波主要用于粉碎细胞，以提取细胞组份或制备抗原等。超声波裂解细菌的机制主要是它通过水时发生的空(腔)化作用，在液体中造成压力改变。 (四)干燥与低温抑菌法 有些细菌的繁殖体在空气中干燥时会很快死亡，例如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍乱弧菌等，但有些细菌的抗干燥力较强，如溶血性链球菌在尘埃中存活可达25天，结核分枝杆菌在干燥的痰中可数月不死。芽胞的抵抗力更强，炭疽芽胞杆菌的芽胞耐干燥可达20多年。干燥法常用于

44、保存食物，浓盐或糖渍食品可使细菌体内水分散失，造成生理性的干燥，细菌的生命活动停止，防止食物变质。 低温可使细菌的新陈代谢减慢，常用做保存细菌菌种，当温度回升至适宜范围的时候，又能恢复生长繁殖。为避免解冻时对细菌的损伤，可在低温状态下真空抽去水分，此法称为冷冻真空干燥法。消毒知识点化学消毒法 化学消毒法是利用化学药物杀死或抑制病原微生物的方法。具有杀菌作用的化学药品称化学消毒剂；用于抑制微生物生长繁殖的化学药品称防腐剂。化学消毒剂不仅对细菌有毒害作用，对人体组织细胞也有损伤作用。因此，只能外用或用于环境的消毒。 根据化学消毒剂的杀菌机制的不同，主要分为以下几类： (1) 促进菌体蛋白质变性或凝

45、固，例如酚类(高浓度)、醇类、重金属盐类(高浓度)、酸碱类、醛类； (2) 干扰细菌的酶系统和代谢，例如某些氧化剂、重金属盐类(低浓度)与细菌的-SH基结合使有关酶失去活性； (3) 损伤细菌的细胞膜，例如酚类(低浓度)、表面活性剂、脂溶剂等，能降低细菌表面张力并增加其通透性，胞外液体内渗，致使细菌破裂。 酚类：石炭酸、来苏、洗比泰等酚类化合物，低浓度时破坏细菌细胞膜，使胞内容物漏出；高浓度时是菌体蛋白质凝固。 醇类：杀菌机制在于去除细菌胞膜中的脂类，并是菌体蛋白质变性。乙醇最常用，浓度7075%时杀菌力最强，高浓度因能使菌体表面蛋白质迅速凝固，杀菌力反而降低。 重金属盐类：高浓度时与带阴性电

46、荷的菌体蛋白质结合，使之发生变性或沉淀，也可以与细菌酶蛋白的-SH基结合，使其丧失酶活性。 氧化剂：常用的有过氧化氢、过氧乙酸、高锰酸钾与卤素等。杀菌机制依靠其氧化能力。过氧乙酸为强氧化剂，对细菌的繁殖体和芽胞、真菌、病毒等都具有杀灭作用，应用广泛，但易分解并具有刺激性和腐蚀性，不适用于金属器具的消毒。用于消毒的卤素有碘和氯两类，碘多用于皮肤的消毒，氯多用于水的消毒。氯化合物有漂白粉、次氯酸钙、次氯酸钠等。 表面活性剂：常用于消毒的表面活性剂有新洁尔灭。 烷化剂：杀菌机制在于对细菌蛋白质和核酸的烷化作用，杀菌谱广，杀菌力强。常用的有甲醛、环氧乙烷和戊二醛等。缺点是有些对人体有毒性，并且有些烷化

47、剂可能有致癌作用。 消毒知识点影响消毒灭菌的效果因素 1 消毒剂的性质、浓度与作用时间 消毒剂在一定浓度下，对细菌的作用时间越长，消毒效果越好。 2 微生物的种类与数量 同一消毒剂对不同微生物的杀菌效果不同，一般的消毒剂对结核分枝杆菌的作用要比其他细菌繁殖体作用差；70乙醇能杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细菌的芽胞，必需根据消毒对象选择合适的消毒剂。此外，微生物的数量越大，所需要的消毒的时间就越长。 3 温度 温度升高可以提高消毒效果。 4 酸碱度 消毒剂的杀菌作用受酸碱度的影响，例如戊二醛本省呈中性，其水溶液呈弱酸性，不具有杀灭芽胞的作用。 5 有机物 环境中有机物的存在可影响消毒的效果。

48、细菌检验基本技术：芽胞染色、荚膜染色及鞭毛染色 1 芽胞染色 用着色力强的染色剂孔雀绿在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而进入芽胞一经着色则很难被水洗脱色。当用复染剂染色后，芽胞仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽胞囊被染成复染剂的颜色，使芽胞和菌体更容易区分。 芽胞染色的操作步骤： 制成菌悬液孔雀绿染色分钟将试管水浴加热分钟一用接种环取加热染色菌液制成涂片干燥固定水洗脱色蕃红花或稀释石炭酸复红复染分钟水洗晾干油镜观察。 2 荚膜染色 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周

49、围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。 在荚膜染色方法中，以负染色法和湿墨水法较为常用，其中湿墨水法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。 3 鞭毛染色 细菌的鞭毛极细，直径一般为，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用镀银法染色。在显微镜下，主要观察菌落结构，表面特征和菌落边缘的形态等。例如炭疽芽胞杆菌菌落边缘呈现大量卷曲的纤丝状纹理，称为狮鬃样菌落；鼠疫菌落表面呈现粗糙的颗粒状突起，在血琼

50、脂平板上生长的菌落边缘带有“花边”；支原体的菌落呈现“荷包蛋”状等。生活饮用水水质微生物检测样品采集及处理知识点水样的采集与保存 1、 水样的采集 1.对容器的要求容器及瓶塞、瓶盖应能经受灭菌的温度，并且在这个温度下不释放或产生任何能抑制生物活动或导致死亡或促进生长的化学物质。玻璃或聚丙烯塑料容器用自来水和洗涤剂洗涤，然后用自来水彻底冲洗。用硝酸溶液（1+1）浸泡，再用自来水，蒸馏水洗净。 为了除去余氯，在灭菌前向容器里加入硫代硫酸钠以还原余氯每125ml水样加0.1ml硫代硫酸钠（100gL）。 2容器灭菌热力灭菌是最可靠而普遍应用的方法。热力灭菌分干热和高压蒸汽灭菌两类。聚丙烯瓶只能用高压

51、蒸汽灭菌，玻璃瓶可用两种方法灭菌。干热灭菌之后，玻璃容器是干燥的，便于保存和应用；高压蒸汽灭菌之后，应自灭菌器中取出放在烤箱内烤干，干热灭菌所需温度较高、时间较长。高压蒸汽灭菌法要求12115分钟，即可杀死芽胞。干热灭菌法杀死芽胞需160180、维持2小时。 3为了除去余氯，在灭菌前向容器里加入硫代硫酸钠以还原余氯每125ml水样加0.1ml硫代硫酸钠（100gL）。 4采集自来水时应开启水龙头，适当放水数分钟后再取样。 二、水样的保存方法 4保存，4小时内进行检验。   医疗机构污水和污泥样品的采集和处理知识点医疗机构污泥的采样和样品处理   

52、;  所采集的样品应具有代表性，制成约500g的表层和中层的平均混合样品，置于无菌容器中带回实验室。     污水样品采集后应按检验要求尽快检验，如不能及时检验，应将样品放置冰箱内保存，并应在6小时内检验。     （一）检测粪大肠菌值时样品的采集及处理     称取采集的污泥样品100g，溶解于100ml无菌生理盐水中，充分搅拌均匀，用无菌吸管吸取此混悬液2ml，加入发酵管中培养；并将此混悬液依次稀释后，吸取不同浓度的稀释液

53、按检验要求接种发酵管培养。     （二）检测沙门菌和志贺菌时样品的采集和处理     称取采集的污泥样品30g，放入灭菌容器内，加入300ml无菌生理盐水，充分搅拌混匀，制成110混悬液，用无菌吸管吸取此混悬液100ml加入相应增菌液中培养。     （三）检测结核杆菌时样品的采集和处理     称取采集的污泥样品10g，放入灭菌容器内，加入100ml无菌水冲洗过滤（滤纸漏斗），再经玻璃漏斗G2

54、（孔径1015pm）和G4（孔径34pm）抽滤，最后再经滤膜（孔径0.450.7靘）抽滤。取下滤膜，用4硫酸3ml，充分振荡冲洗30分钟。取上述酸性溶液各0.1ml，分别接种培养。     （四）检测蛔虫卵时样品的采集和处理     采集回的样品应立即检验，如不能立即检验应加入510ml 3或5甲醛或3盐酸溶液，用平皿盖住广口瓶瓶口，然后放于冰箱内，以防止微生物繁殖和蛔虫卵的发育。  医疗机构污水和污泥样品的采集和处理知识点医疗机构污水的采样和样品处理 &

55、#160;   所采集的样品应具有代表性，采集后应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验，如不能及时检验，应将样品放置冰箱内保存，并应在6小时内检验。     （一）检测总余氯指标时样品的采集及处理     1所检测样品需在医疗机构污水最终排放口处用冲洗干净的玻璃容器采集。     2采样后应立即检测，避免强光、振荡及温热等因素的影响。     为避免污水中悬浮

56、性固体对检测结果的影响，可用离心机离心分离，弃去悬浮物沉淀。     3被测样品的温度应在1520。如低于此温度，应先将盛样品的玻璃容器放人温水中，使其温度升至要求温度后，再测定数值。     （二）检测粪大肠菌群时样品的采集及处理     1用采水器或其他无菌容器采取污水样1000ml，放入灭菌瓶内（加氯消毒处理的污水应加1.5硫代硫酸钠溶液5ml中和余氯）。     2采集好的水样应立即运往实

57、验室检验，一般不宜超过2小时，否则应在10下保存样品，但需在6小时内检测。     （三）检测沙门菌和志贺菌时样品的采集和处理     1用采水器或其他无菌容器采取污水样1000ml，放入灭菌瓶内（加氯消毒处理的污水应加1.5硫代硫酸钠溶液5ml中和余氯）。     2采集好的水样应立即运往实验室检验，一般不宜超过2小时，否则应在10下保存样品，但需在6小时内检测。     3取污水250ml，用

58、无菌纱布或脱脂棉进行初滤，然后用滤膜进行抽滤，将初滤后的纱布或脱脂棉和滤膜，放入相应的增菌液中进行增菌培养。     （四）检测结核杆菌时样品的采集和处理     1用采水器或其他无菌容器采取污水样1000ml。放入灭菌瓶内（加氯消毒处理的污水应加1.5硫代硫酸钠溶液5ml中和余氯）。     2采集好的水样应立即运往实验室检验，一般不宜超过2小时，否则应在10下保存样品，但需在6小时内检测。     3根据检验条件，可选用滤膜集菌法和离心集菌法进行集菌，然后进行接种和培养。