激光扫描共聚焦显微术在淋巴瘤研究中的应用

1、    激光扫描共聚焦显微术在淋巴瘤研究中的应用        激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM）自80年代初问世以来，较好地解决了扫描过程中的荧光标本的光漂白等作用，像清晰度高，特别适用于观察较大标本的内部组织结构，其三维重建功能清晰显示了膜和核的关系，已被广泛应用于医学、生物学领域和工业固体材料的显微结构研究1。血管免疫母细胞性T细胞性淋巴瘤（angioimmunoblastic T-cell lymph

2、oma, AILD-TCL），是系统性的淋巴增生性疾病。临床表现有发热、淋巴结肿大、肝脾肿大、皮疹等，并包括多项血液指标的改变。形态学上有淋巴结结构破坏、“烧光”的生发中心、血管增生、过碘酸雪夫染色(PAS)阳性物质沉积等。CD44是分布广泛的细胞表面跨膜糖蛋白分子，主要参与细胞间及细胞与基质间的特异性粘连过程。CD44s (标准型CD44) 可促进局部肿瘤的形成, 主要分布在细胞膜上。Ki-67是Gerdes等21983年报道的一种单克隆抗体，其抗原存在于增殖细胞核基质内，是与细胞增殖相关的一组核蛋白。我们用LSCM技术和双重免疫组织化学染色作对比，来观察AILD-TCL的CD44s和Ki-

3、67的表达，进一步研究AILD-TCL中增生细胞的形态学。一、材料与方法1.病例来源：病例来自本院病理科1998年的冷冻和石蜡组织。2.仪器设备：激光扫描共聚焦显微镜MRC-1024ES型（英国Bio-Rad公司），主要包括倒置显微镜、激光光源、电脑控制和输出等4部分。电热恒温培养箱（美国Sheldon Manufacturing公司）。3.试剂和方法：将石蜡标本行4 m连续切片，作双重免疫组织化学染色。第一步采用免疫组织化学SP法（一抗用CD44s，Zymed，即用型产品），用DAB显色；第二步采用免疫组织化学APAAP法（一抗用Ki-67，MIB1同上公司产品），用氮蓝四唑/五溴-四氯三吲

4、哚磷酸酯（NBT/BCIP）显色，甲基绿复染细胞核。将冷冻标本行10 m连续切片，作双重免疫荧光染色。一抗采用CD44s（同上）和Ki-67（同上）。步骤：将冷冻切片置于4%多聚甲醛中固定，室温下20 min；0.01mol/L PBS缓冲液荡洗；150正常兔血清封闭；弃去血清，直接滴加Ki-67单抗的稀释液（1100），37下孵育60分钟；PBS荡洗，加异硫酸荧光素（FITC）标记的兔抗鼠IgG（180，Dako公司）37下孵育30 min； PBS液荡洗，加双标染色增强剂（同上公司，即用型产品）1滴，室温下30分钟；弃去增强剂，直接滴加CD44s，37下孵育2 h； PBS荡洗，加藻红蛋白

5、RPE标记的兔抗鼠IgG（140，Dako公司），37下孵育30 min； PBS液荡洗，缓冲甘油（甘油和PBS液11混合）封片。4.激光共聚焦显微镜断层扫描：选择参数如下：激光光源波长488 nm/514 nm,氪-氩离子激光器功率25 mW，像尺寸512×512像素。扫描模式为XY和XZ。（1）双重荧光标记和细胞“CT”：将染色好的标本放在LSCM（60×油镜）上进行预扫描，确定细胞的顶部后，按Z轴步距(0.5 m)逐层往细胞底部扫描，计算机同时记录每层的像数据。探测器选用高灵敏度光电倍增管2个，可见光激发。在第二通道先扫描细胞膜，然后于第一通道扫描细胞核，二者在Fra

6、me/overl2下重叠成像。（2）三维重建： 先确定细胞的顶部，然后按Z轴步距(0.5 m)逐层往细胞底部扫描，通过SFP（simulated fluorescence process）选项，获得清晰三维像。（3）摄像：在输出设备Video-Printer下对双重荧光标记、细胞“CT”和三维重建所产生的像进行全屏幕摄影。二、结果1.双重免疫组织化学染色：细胞核呈紫蓝色，细胞膜呈棕色，在部分细胞（透明细胞及免疫母细胞）上可见CD44s 和Ki-67的共表达（1）。 1部分透明细胞及免疫母细胞呈CD44s棕色胞膜阳性表达，Ki-67胞核紫蓝色阳性表达双重免疫组织化学法×3502.双重荧

7、光标记和细胞“CT”：细胞核呈黄绿色，细胞膜呈红色，在部分细胞（透明细胞及免疫母细胞）上可见CD44s 和Ki-67的共表达（2）, 能清晰显示膜和核的关系。3.三维重建：激光共聚焦显微镜断层扫描的信息用SFP选项进行伪彩色三维重建，重建像的各种信息均可在屏幕上显示3。像上可见：中等大的透明细胞核呈圆形或卵圆形，染色质细，核仁小，大透明细胞核呈圆形或轻度不规则，有嗜酸性细胞样的核仁。膜与核的间隙较宽，是丰富淡染的水样胞质的位置。这些像可在X，Y，Z轴上任意角度旋转显示。2冷冻切片，激光共聚焦显微镜下可见Ki-67标记呈胞核阳性(黄绿色荧光)，CD44s呈胞膜阳性(红色荧光)，部分细胞有二者的共

8、表达双重免疫荧光法×600三、讨论1.我们应用激光共聚焦显微技术得到AILD-TCL的高质量像，原理如下：（1）一般荧光显微镜在观察样本时，焦点平面以外的荧光会减低像的清晰度，显示的是平面叠加象。而LSCM在观察某一焦点平面的荧光时，把焦点平面以外的荧光删除，得到焦点平面清晰的像。（2）LSCM采用台阶扫描方式，把激光束固定于一个完整的光轴上，对样品进行扫描而建立共焦像，避免了因偏轴扫描产生的横向色差效应，因此大大提高像的分辨率，获得高质量像资料。双重荧光标记和三维重建还可显示不同光切面的膜和核的相互关系，为研究2种或2种以上相关因素的关系提供了方便。2.我们仅应用激光共聚焦显微镜的

9、部分技术，观察CD44s和Ki-67在AILD-TCL的表达，较双重免疫组织化学的结果为好。由于激光共聚焦显微镜的像清晰度高，获得了细胞内部不同的信息，拓宽对淋巴瘤的抗原表达研究的视野，由平面水平深入到立体水平，克服了普通光镜的局限性。因而为研究淋巴瘤的形态结构和提高病理诊断水平提供了一种新的手段。作者单位：王雪（四川华西医科大学附属第一医院病理科610041 成都）李甘地（四川华西医科大学附属第一医院病理科610041 成都）张杰（四川华西医科大学附属第一医院病理科610041 成都）步宏（四川华西医科大学附属第一医院病理科610041 成都）李俸媛（四川华西医科大学附属第一医院病理科610

10、041 成都）刘卫平（四川华西医科大学附属第一医院病理科610041 成都）张尚福（四川华西医科大学附属第一医院病理科610041 成都）参考文献1，Knoester A, Brakenhoff GJ. Applications of confocal microscopy in industrial solid materials: some examples and first evaluation. J Microsc, 1990，157：105.2，Gerdes J,Schwabu, Lemke H, et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with