污染物高效降解微生物的分离培养

1、9.8 污染物高效降解微生物的分离培养 微生物是地球生态系统中最重要的分解者，也是人类生存环境的重要组成部分，同时也是人类极其宝贵的资源库。它与人类的生产、生活，对人类的生存发展，有着十分密切的关系。人们在治理污染、保护环境的不懈努力中，在为遇到种种难题所困扰的同时，已经自觉或不自觉地利用并发挥着环境有益微生物的作用，而且在实践中越来越认识到微生物在污染物降解、资源再生利用、绿色产品生产、生态环境保护等方面的重要作用和巨大潜力。获取高效菌种是开发应用环境有益微生物、并进一步实现产业化的基础，是该领域研究、开发工作的源头，也是产业化发展的核心与关键。9.8.1 分离培养的基本原则和方法9.8.1

2、.1 确定分离培养目标 了解目标菌（微生物）的分布、营养、生长等特点，以及它们具有的或应具有的一些功能特性，并进而制定试验方案。如用于生物脱氮或NH3-N去除、转化的硝化细菌和反硝化细菌的分离，前者应是具有氨氧化作用的亚硝酸细菌和能氧化亚硝酸为硝酸的硝酸细菌。又如用于有机生活垃圾的快速处理与利用的高效微生物的分离，这些微生物的作用应能有效地使垃圾达到无害化、减量化、资源化，因此它们的发酵温度应该很高，即应具有耐高温的特性，以及对蛋白质、纤维素等有机物的很高的分解能力。9.8.1.2 选择分离源 以目标微生物上述特征为依据，选择并确定分离源。该分离源应具备以下条件：（1）所处的条件较有利于目标微

3、生物的生长。（2）存在有较大的数量。（3）有可能具备为目标菌设定的功能特性。9.8.1.3 分离“筛”的设定是选择培养法的核心（1）选择培养基的利用。 根据目标微生物特定的营养要求，设计相应的选择培养基。例如，可利用不加氮源的培养基来分离固氮菌；解酚菌的培养基中应以酚作为碳源。（2）选择培养条件的利用。 可利用目标菌对氧、光、pH、温度、盐分、压力等的不同要求来设定选择培养条件。例如，可用摇床培养来满足好氧菌生长时对氧的要求；为分离芽孢杆菌，可利用芽孢耐高温的特性，预先对样品用800C水浴处理1020分钟。（3）对毒物、抗菌素等特殊的敏感性或耐受性的利用。 例如，分离放线菌时可加重铬酸钾来抑制

4、细菌和霉菌生长，其加量为每300ml改良高氏一号培养基中加3%重铬酸钾1ml。9.8.1.4 分离样品的破碎、分散处理进行微生物分离培养前，必须对分离样品，如土壤、淤泥、活性污泥或生物膜等等充分破碎、分散，尽可能使着生在土壤粒子内外的微生物、组成污泥菌胶团的微生物都分散成单个细胞悬浮在样品中。样品分散程度关系到分离培养与计数结果的准确性，必须十分重视。具体可采用以下方法： 在放有少量玻璃珠的无菌三角瓶中加入样品(土壤、淤泥、活性污泥、生物膜等)，再加入0.01%的焦磷酸钠作为解絮剂，用旋涡振荡器振荡使样品充分分散后，再用超声波破碎（在冰浴中进行），然后以无菌水稀释备用。9.8.1.5 富集培养

5、 利用目标微生物对营养、生长条件、毒物敏感性、生长速度等方面的特点，也即利用设定的筛子先进行富集培养，使分离源中的目标微生物数量增加，有用的性状得到改善与提高。（1）增加目标微生物的数量，提高优势度。（2）与定向驯化培养相结合，提高、改善目标微生物某些特定的性状。（3）减少非目标微生物的数量。（4）有利于获得与特定环境相融性好的目标微生物群体。9.8.1.6 目标微生物的分离纯化 （1）用稀释平板法(混菌、涂布或划线分离)或MPN法进行分离纯化。 挑取单菌落，获得一批菌株，并进一步作纯化分离，最后得到纯菌株。（2）性状确认，并与筛选相结合，好中选优。9.8.1.7 纯化分离菌株的保存 菌种保存

6、时一般都要求不受杂菌污染，菌株变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。同时，还应注意以下事项：（1）做好菌种保存记录，注明菌株名称、分离年月日、分离者姓名、 分离地点等，还应记录有关菌株性质的数据。（2）为防止杂菌污染及意外事故，一种菌应保存23支试管备用。（3）原始菌株必须妥善保存。 具体保存方法请参考有关文献。 9.8.2 细菌、放线菌、真菌和酵母菌的计数与分离9.8.2.1 计数用培养基 细菌、放线菌在清蛋白琼脂培养基上，280C、培养10天计数。 清蛋白琼脂培养基配方：蛋清蛋白 0.25 gFe2(SO4)3微量葡萄糖 1.0g 琼脂 15 gK2HPO4 0.5g水 1

7、000 mlMgSO47H2O0.2 g pH6.87.0蛋清蛋白用0.1N NaOH数mL溶解，加一滴酚酞，使呈微红色即可。该培养基适于营养贫瘠型类群计数使用。非贫营养型细菌的计数可采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配方：牛肉膏35g琼脂1520g蛋白胨10 g水1000 mlNaCl5 g pH7.07.2121， 20 min 若培养厌氧菌，则再加入：半胱氨酸-HCl 0.3g 真菌在孟加拉红琼脂培养基上，25、培养35天计数. 孟加拉红琼脂培养基配方：KH2PO41.0g孟加拉红0.033gMgSO47H2O0.5g 琼脂20 g蛋白胨5.0g水1000 ml葡萄糖1

8、0.0gpH6.8100ml培养基中加入1/300孟加拉红1ml，加压灭菌，冷却至4245时，无菌地加入经赛氏滤器过滤除菌的链霉素30微克/毫升或金霉素2微克/毫升。9.8.2.2 细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的区别方法不论是何种培养基，除加有抑制剂外，一般三大类菌都可能生长，所以应了解它们菌落特征的基本区别。细菌：菌落小，细胞球状（直径0.51.0m），杆状（宽0.51.5m，长1.04.0m)。放线菌：菌落较细菌干燥，不光滑，与培养基结合较牢.菌丝细（宽约1.0m），直径与细菌相仿，分枝不分隔，可扩展成放射状；一般有基内菌丝、气生菌丝和孢子丝之分，由孢子丝产生孢子。孢子的颜色、形状大小和菌丝

9、体可溶性色素的有无等特征，是菌种鉴别的主要依据之一。 霉菌：霉菌是丝状真菌的通称。菌丝粗大，宽约4.08.0m，无色透明或呈现各种鲜艳的颜色，有营养菌丝与繁殖菌丝之分.多数霉菌菌丝有分隔，为多细胞分枝丝状体.菌落疏松呈絮状.孢子成熟时使菌落表面呈粉末状或颗粒状.孢子颜色因种而异，常与霉菌的水溶性色素不一而形成菌落正反面呈现不同颜色.各种霉菌在一定的培养基上生长形成的菌落大小、形状、颜色等特征相对稳定，是霉菌鉴定的主要依据之一。酵母菌：多数酵母菌菌落与细菌相似，但较大而厚，且多数不透明。大多菌落光滑、湿润、粘稠，乳白色，少数干皱，呈红色或粉红色。菌体直径410m，圆形、椭圆 形、卵形、柠檬形、黄

10、瓜形等，在液体培养中酵母菌体生长常会生成沉淀或形成菌膜。这些都是菌种鉴定的依据。9.8.2.3 放线菌的分离培养 放线菌为G+、单细胞原核微生物，菌体丝状，分枝而不分隔，一般有基内菌丝、气生菌丝及孢子丝之分。放线菌中有许多种类产抗生素，诺卡氏菌的某些种在石油脱蜡、烃类分解、丙烯腈废水的处理中起作用，还有的种可分解纤维素、木质素。 放线菌分离方法如下：（1）样品充分分散，并制成稀释悬液，分纯培养宜取高稀释度。（2）在稀释液中加细菌抑制剂：链霉素 2550/ml，或30%酚 10滴。再加霉菌抑制剂：制霉菌素 50/ml。（3）培养基：Waksman清蛋白培养基：蛋清蛋白0.25g琼脂1520gFe

11、2(SO4)30.01gH2O1000 mlMgSO47H2O0.2 gpH6.87.0葡萄糖1 g 蛋清蛋白用0.1N NaOH数ml溶解，此培养基可供菌数测定及菌种纯化分离使用。 改良高氏一号培养基：FeSO47H2O0.01gK2HPO4 0.5gMgSO47H2O0.5g淀粉(可溶性)20g NaCl0.5gH2O1000ml KNO31.0g 以少量水把淀粉调成糊状后加入培养基中.每300ml培养基中加3%重铬酸钾1ml，以抑制细菌和霉菌的生长.（4）平板分离：平板涂布分离培养：接种菌悬液取0.1ml.推布均匀。平板混菌分离培养：接种菌悬液取0.51ml，加入无菌平皿，倒入 450C

12、左右的培养基，混匀。把接种好的平板置于25300C，培养715天。（5）在上述平板上挑取单菌落，接入高氏一号培养基平板，进行纯化培养，280C，培养714天（一般7天）。9.8.2.4 酵母菌的分离培养 酵母菌与人类关系密切。菌体内蛋白质含量高，含多种氨基酸、VB、脂肪及其他生长因素。酵母菌许多种具有同化烃类化合物的能力，分解石油中的的蜡质，使凝固点降低，并获得大量菌体；还可用于酒精废水、屠宰废水、糖蜜废水等的处理与资源化，得到饲料酵母。另据研究，热带假丝酵母对含酚废水有很好的处理效果。 酵母菌往往生长在含糖较高的环境中。多数为腐生，喜偏酸条件，最适pH为4.56。在酸性液体培养基中酵母菌比霉

13、菌生长快，酸性又可抑制细菌生长，故可用于酵母菌的富集培养。（1）培养基 乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200 g乳酸5 mL 葡萄糖20 g水1000 Ml制法：马铃薯去皮、切片、称取200g，加水煮沸30分钟，纱布过滤，补足水至1000mL，成20% 马铃薯汁，加入其他成分即成。1150 C， 20分钟， pH自然。 麦芽汁培养基制法： 发芽：大麦或小麦若干，洗净，浸水612小时，150C，暗处发芽，上盖纱布一块，早、中、晚各淋水一次。当麦根长至麦粒两倍时，停止发芽，晒干或烘干备用。 糖化：将麦芽磨碎，1份麦芽加4份水，650C水浴中糖化34小时，用碘液检查糖化程度。 过滤：糖化液用46

14、层纱布过滤。若混浊，可用蛋清一只与20mL水调至生泡沫，加入糖化液中搅拌、煮沸，再过滤。 稀释：将滤清的糖化液稀释至56波美度，pH约6.4，加2% 琼脂，1210C，20分钟灭菌。（2）富集培养 将待分离样品放入盛有无菌水与玻璃珠的三角瓶中，使样品振荡分散后取上清液，接种于乳酸-马铃薯-葡萄糖培养液中（或酸性麦芽汁中），25280C，培养37天，培养液变混浊，产生菌膜或沉淀物。制片，用美兰染液染色。活酵母可还原美兰染液，故菌体无色。（3）分离 取富集液，经适当稀释，吸取0.2mL接入马铃薯-葡萄糖琼脂平板或麦芽汁琼脂平板，用玻璃棒涂布。正放于25280C，培养24小时，表面水份吸干后再倒置培

15、养。（4）纯化与保存 挑取单菌落，用平板划线分离、纯化。纯化后的菌株接种于麦芽汁琼脂斜面培养基上，培养2天后注入液体石蜡（无菌石蜡要灭菌2次以上）。45保存。9.8.2.5 丝状真菌(霉菌)的分离培养 霉菌喜生存于偏酸性、有机质较丰富的环境。绝大多数为好氧菌。 霉菌中不少菌种被应用于发酵食品、制有机酸、抗生素、酶制剂。还有人利用镰刀霉处理含氰废水，利用根霉、毛霉处理酒精废水，显示了较强的分解有机质的能力。 霉菌分离的主要关键是选择合适的培养基和控制适宜的培养条件。（1）培养基 马铃薯培养基：马铃薯200 g 蔗糖20 g琼脂1520 g水1000 mLpH 自然，制法同酵母菌的乳酸-马铃薯-葡

16、萄糖培养基。 马丁（Martin）培养基：蛋白质5gMgSO47H200.5g葡萄糖10gKH2PO41.0g琼脂1820gH2O 1000 mL 加入1%孟加拉红水溶液3.3mL.1210C，20分钟灭菌. 临用时每100mL培养基加入1%链霉素溶液0.3mL. 乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基中的葡萄糖改成蔗糖，可用于霉菌培养。 查氏培养基：蔗糖30gFeSO40.01g NaNO32.0gMgSO47H200.5gKCl0.5 g琼脂1820gK2HPO41.0gH2O1000mlpH自然，1150C，灭菌20分钟。 其他： 利用一些特定的材料作培养基，如可利用新鲜橘皮培养青霉，利用甜酒曲培养

17、根霉等等。（2） 霉菌的分离与纯化 将分离用的样品，以无菌水制成一系列10倍稀释悬液。 根据样品来源选择适当的培养基。分离土壤样品较多采用马丁（Martin）琼脂培养基或马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，霉变材料及河塘泥、生物膜等样品中霉菌的分离多用查氏琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖琼脂、或马丁氏琼脂等。 用无菌吸管分别吸取0.51mL不同稀释度的菌悬液，接入无菌平板，按常规的混菌法或涂布法进行分离操作.每个稀释度一般做三个平皿. 置于23280C培养37天，待菌落长好作进一步分离纯化. 依据菌落形状、质地和正反面颜色，判断是否为纯培养物。如有细菌或其他杂菌污染，则可挑取霉菌孢子或菌丝，用平板划线法重复分

18、离纯化。对于形成固定菌落的如青霉、曲霉等，可用稀释平板混菌法分离纯化。菌落不定形、蔓延繁殖的如根霉、毛霉等，因两个菌落极易接触混杂，故分离时需采用较高的稀释度或以培养1624小时内生长的菌丝接种。 9.8.3 特定微生物的分离培养9.8.3.1 芽孢菌的分离培养 芽孢菌参与许多有机物的转化及生物降解，多数为好氧或兼性厌氧微生物，菌体杆状或球状。芽孢是在菌体内形成的圆形或椭圆形的内生孢子。芽孢的代谢活力弱，对不良环境如高温、干燥、化学药品等的抵抗力强。 分离步骤如下：（1）将水样接种于刺激芽孢生长的培养基中，350C培养1824小时。将培养好的菌悬液置于800C水浴中加热1020分钟以杀死不能形

19、成芽孢的菌体。 刺激芽孢生长的培养基如下：蛋白胨10gKH2PO41.5g酵母膏3gNa2HPO42 g淀粉3gH2O1000 mlMgSO47H2O0.1gpH7.81210C，15分钟（2）将加热处理过的菌悬液稀释为10-3、10-4、10-5，分别取0.5mL接入无菌平板，倒入芽孢菌分离培养基，混匀，置于35，培养1824小时。 芽孢菌分离培养基如下： 用营养琼脂培养基与70Bx麦芽汁培养基，溶化后以1:1的量混匀即成.营养琼脂培养基配方为：肉膏35gNaCl5 g 蛋白胨10 g琼脂1520g H2O1000mlpH 7.07.2121，20分钟 （3）挑取单菌落作分离纯化培养： 单菌

20、落液体培养基菌悬液划线分离，经数次重复，直至由单个细胞形成单独的菌落。9.8.3.2 硝化细菌的分离培养 在污水、污泥或土壤中，有机氮化合物经氨化细菌作用，分解成氨，硝化细菌又将氨氧化成硝酸盐，此过程为硝化作用。它包括两个连续的阶段：首先，氨经亚硝酸细菌作用氧化为亚硝酸；亚硝酸又经硝酸细菌作用氧化为硝酸。亚硝酸细菌与硝酸细菌合称为硝化细菌。它们都为好氧化能自养菌。此外，还有一些异养细菌和放线菌、真菌中的某些种类，也能将氨转化成亚硝酸或硝酸。硝化细菌的分离纯化比较困难，主要是因为硝化细菌生长缓慢，而伴生的异养细菌生长迅速。在选择性较强的硅胶平板上长出的菌落很小，直径仅有100m，分离难度很大。（

21、1）亚硝酸细菌的分离培养 样品采集 作为亚硝酸细菌的分离源，可采取湖泊中的表层淤泥、沟渠软泥或城市污水厂的活性污泥。 亚硝酸细菌富集培养基：(NH4)2S042gK2HPO4 1gMgSO4 7H200.5gCaCO35gFeSO47H2O0.4gH2O1000mL NaCl2gpH 7.2 除CaCO3外，其余成分溶解于水中，装瓶后按0.5%的比例加入CaCO3，1210C，灭菌20分钟。 若培养硝酸细菌，则以KNO2 2g代替(NH4)2S04。 亚硝酸细菌富集培养 目的是大量淘汰异养细菌，增加亚硝酸细菌的菌数。具体方法如下： a. 取泥样0.51g，投加于富集培养液中，混匀，置于280C

22、下培养23天后，开始检测NO2-盐的生成，通常在7天左右NO2-盐大量出现。 b. 当检出NO2-盐后，取0.1mL富集培养液接种到新鲜的富集培养基中，继续培养并检测NO2-盐。 c. 经7次重复富集培养后，开始连续供给能源，即每隔35天，添加5%硫酸铵溶液23mL，并加入适量碳酸钙。 硅胶平板培养基的制备 将硅酸钾或硅酸钠配制成比重为1.10的溶液，过滤澄清。取比重为1.09的盐酸，与等体积的上述溶液混合。操作时将硅酸钠缓慢加入盐酸内，搅拌均匀，倒入培养皿内。每皿2025mL，静置24小时，待凝固成平板后用缓流水冲洗23天，以除去氯离子，直至Cl-完全消失。滴加1%硝酸银溶液测试，如呈白色，

23、表明有Cl-需继续冲洗。冲洗后的平板用煮沸的蒸馏水冲洗三次以灭菌。或用紫外线照射灭菌。操作时将培养皿置于距紫外灯20cm处，照射30分钟，皿盖置于一边同时灭菌。然后，在每个硅胶平板上加亚硝酸菌富集培养基2mL和5%(NH4)2S04 溶液1mL。轻轻转动培养皿，使培养液分布均匀。打开皿盖在500C烘箱内烘至平板无水流动为止。 .亚硝酸细菌的分离纯化 用无菌吸管吸取0.10.2mL富集培养液，接种到上述制成的硅胶平板上。用无菌玻璃推棒将菌液均匀涂布在平板上。置于底部盛水的干燥器内（防水分蒸发，免使平板干裂），在28300C下培养1530天。当硅胶平板出现亚硝酸细菌菌落后，挑起菌落再接种到液体培养

24、基中，通过测定NO2-的生成来确定亚硝酸细菌的增殖情况。同时，取少量培养物接种到肉汤蛋白胨培养基中，如观察到培养液中有异养细菌生长，则必须重复以上的纯化分离操作。也可用接种环挑取富集培养液，点种于硅胶平板分离培养基表面。在皿盖上放一张湿滤纸或如前法培养。由于硅胶平板有高度的选择性，在点样周围的菌落均是亚硝酸细菌。 (2) 硝酸细菌的分离培养 取污泥或土壤少量，分别接种于硝酸细菌富集培养液中，混匀，30培养。在富集培养时要连续供给5%亚硝酸铵溶液数毫升，以代替硫酸铵，也有利于抑制其他菌的繁殖。 硝酸细菌的分离纯化方法，原则上与亚硝酸细菌相同，可采用硅胶平板法。但在硅胶平板上要加5%亚硝酸铵溶液1

25、mL以替代硫酸铵溶液，还要投加硝酸细菌培养基2mL。培养后，在硅胶平板深层形成针头状菌落。也可利用硝酸细菌富集培养基中投加1.52%琼脂，制成固体平板，用此平板进行分离纯化。9.8.3.3 纤维素分解菌的分离培养 纤维素是组成植物细胞壁的主要成分，是地球上存在量最为丰富的有机物。它性状比较稳定，不易分解。因此，它是一类数量庞大的环境污染物，同时又是一项可开发利用的宝贵资源，它的综合利用具有广阔前景。自然界有一部分细菌、放线菌和真菌能诱导产生纤维素酶，进行纤维素的分解。能分解纤维素的好氧细菌主要有： 噬纤维黏菌属(Cytophaga)、 生孢噬纤维黏菌属(Sporocytophaga)、 纤维弧

26、菌属(Cellvibrio)， 分解纤维素的厌氧细菌有： 奥氏梭菌(Clostridium omelianski)、 高温溶纤维梭菌(C. Thermocelluloseum)等。 真菌中主要有以下属的一些种： 木霉(Trichoderma)、 葡萄状穗霉(Stachybotrys)、 葡萄孢霉(Botrytis)、 曲霉(Aspergillus)、 青霉(Penicillium)、 毛壳霉、 好热霉 (Thermomyces)。 放线菌的诺卡氏菌属（Nocardia）、链霉菌属（Streptomyces）、小单胞菌属（Micromonospora）中也都有一些能分解纤维素的种。(1) 好气性

27、纤维素分解菌的分离 分离源 草地表层土壤、堆腐烂植物体、湖水等可作为好气性纤维素分解菌的分离源 培养基 Dubos纤维素培养基：NaNO30.5gK2HPO41gFe2(SO4)37H2O微量H2O1000mLMgSO47H2O0.5gpH7.5KCl0.5g 滤纸剪成小条，放入试管中，使略露出液面. Hutchison培养基：KH2PO41gFeCl30.01gMgSO47H2O0.3gNaNO32.5gCaCl20.1gH2O1000mLNaCl0.1gpH7.27.4 若制平板，加琼脂1820g，1210C，灭菌15分钟. 操作方法 a. 将采取的待分离样品，用无菌水制成10-110-3

28、不同稀释度的悬液。 b. 用无菌移液管吸取上述样品悬液，接种于装有10mL Dubos纤维素培养基的试管内 c. 置于25270C条件下培养。 每天观察培养管内的变化，注意液面附近的滤纸变薄或出现斑点。如果分解旺盛甚至可见滤纸条被完全切断。 d. 将无菌的Hutchison培养基融化，注入灭菌培养皿内，制成平板。把上述试管内正在破碎的滤纸适当稀释制成悬液，吸取0.5mL接入平板上，用玻璃推棒涂布均匀，再在琼脂表面覆盖一张无菌滤纸，用玻璃棒（或玻璃刮刀）压平，使滤纸紧贴在琼脂表面。 e. 把上述平板置于底部盛水的干燥器隔板上，28300C，培养710天。 f. 纯化分离 用接种环挑取滤纸上的菌落

29、，在含0.1%葡萄糖（过滤除菌）的赫氏平板上划线分离。重复数次，直至分纯。 g. 将滤纸剪成小片，灭菌后放到无碳源的赫氏培养基平板上。把在葡萄糖赫氏平板上生长的菌落，移接到滤纸片上，并在皿底相对应地编号。经培养后确认分解滤纸的菌种，从相应的葡萄糖赫氏平板上移接到赫氏液体培养基（不加琼脂）的滤纸条上保存。 厌气性纤维素分解菌的分离 取1g土壤（或稀释到10-2的菌悬液1mL），接种到已灭菌的磷酸铵钠培养基中，28300C，严格厌氧培养。培养2周左右，滤纸溶解后，再重复移殖34次，或取滤纸上生长的斑点，黄色部分，经稀释后在平板上涂布分离。 磷酸铵钠培养基配方如下：Na(NH4)HPO42gCaCO

30、35gKH2PO41gCaCl26H2O0.3gMgSO47H2O0.5g蛋白胨1gH2O1000mL 分装试管，液层要较高，以利于深层培养。同时，插入滤纸条，一端露出液面。1210C灭菌20分钟。 注意：滤纸使用前必须检查是否有淀粉。可在滤纸上滴加 稀碘液，如显兰色，示有淀粉存在。则可用1%稀醋酸浸泡 一昼夜，用碘液检查确认无淀粉后，再用2%苏打水冲洗至中性，干热灭菌后备用。 9.8.3.4 解酚菌的分离培养 在工业废水的生物处理中，针对一些特定的污染物，分 离、选育高效降解菌 并接种到活性污泥或生物膜中，往往可 使处理效果明显提高。酚是多种工业废水中大量存在的有机 污染物，含酚废水的排放量

31、相当大，而且较高浓度的酚对生 物具有毒性。因此，提高含酚废水的处理效果，或使发生故 障的系统及时恢复处理效果，一直是该领域有关人员十分关 注的问题。而高效解酚菌的分离培养和应用是解决上述问题 的有效途径。这里就酚分解微生物的分离培养方法作一简要 介绍。 培养基 营养肉汤液体培养基肉膏35gNaCl5g蛋白胨10gH2O1000mlpH7.07.21210C，20 营养肉汤琼脂培养基 肉膏35gNaCl5g蛋白胨10g琼脂1520gH2O1000ml pH 7.07.2，1210C，20 尿素培养基10%尿素5mlMgSO40.05g葡萄糖1gH2O995mLK2HPO40.1gpH77.5 配

32、制时，除尿素外，其它成分混合在蒸馏水中，调pH至77.5，1150C灭菌10分钟，待培养基稍冷，以无菌操作加入事先灭菌（过滤除菌）的尿素溶液，备用。 步骤 采样： 在高浓度含酚废水流经的场所采样。采取排放含酚废水下水道的淤泥、沉渣等，也可在处理含酚废水的活性污泥或生物膜中取样分离。 单菌株分离： 按常规稀释平板法，对上述样品进行单菌株分离。 解酚能力的测定： a 将所分得的菌株，在营养肉汤液体培养基中振荡培养至对数生长期（280C，约1216小时）。 b 培养物中加入少量浓酚液，使培养液酚浓度达到10mg/L左右，进行解酚酶的诱发。 c 继续振荡培养2小时后再次加入浓酚液，使培养液酚浓度提高到

33、50mg/L左右，继续振荡培养4小时。 d 测定培养液中残留酚的浓度，并计算酚的去除率。 菌胶团形成能力的测试： a将已选得的解酚能力较强的菌株，分别接种在盛有50mL灭菌的尿素培养基内 b 28，摇床上振荡培养1216小时，凡能形成菌胶团的菌株，其培养物形成絮状颗粒，静置后沉于瓶底，液体澄清。凡解酚能力较强，且又能形成菌胶团的菌株即为入选菌株经扩大培养后即可提供生产上使用。9.8.3.5 石油降解菌的分离培养 石油降解菌是自然界存在的一大类能以石油为唯一碳源的微生物。它们对环境中碳氢化合物的降解、转化，起着重要作用。随着石油的大量开采、应用以及石油化工生产的发展，大量石油及其制品因油船触礁、

34、油井漏油、井喷等事故进入环境；随石油化工生产排放的废水而进入环境的碳氢化合物量也相当可观。从自然界分离、筛选并应用高效的石油降解菌，是提高石油化工废水处理效果和消除环境石油污染的有效途径之一。 分离石油降解菌用的培养基 石油琼脂基础培养基： 葡萄糖 2g 轻柴油或煤油 10mL 酪蛋白水解物 5g 琼脂 20g 酵母膏 1g 陈海水 1000mL 调pH至7.0，121灭菌20分钟，冷却到450C，加入10mg/L过滤除菌的制霉菌素，制成平板，供分离石油降解细菌用。 上述培养基调pH至5.5，1210C灭菌20分钟，冷却到450C，加入50mg/L链霉素及50mg/L四环素（均预先过滤除菌），

35、制成平板，供分离石油降解真菌及酵母菌用。 石油盐培养基： KNO3 2g 轻柴油或煤油 10mL MgSO47H20 1g 陈海水 1000m 121灭菌20分钟，备用。 石油盐硅胶平板培养基： a. 配制硅酸钾溶液：在100mL加热到近于沸腾的7%KOH溶液中，加入10g硅胶即成。在250mL锥形瓶中倒入50mL硅酸钾溶液，1210C灭菌20分钟，备用。 b. 在250mL锥形瓶中加入50mL石油盐培养基，按0.003%浓度加入酚红指示剂，1210C灭菌20分钟。 c. 当石油盐培养液冷却至室温时，加入0.5mL1%KH2PO4溶液及1mL20%磷酸溶液。 d. 将50mL硅酸钾溶液（pH6

36、7，指示剂红-橙色）倒入上述50mL石油盐培养液中，迅速混合均匀，倒入5个培养皿，每皿约20mL，1分钟后即可凝固成平板。 e. 该平板应使表面干燥后才能使用。 石油降解菌分离操作步骤 选取石油污染近海水域，使用采水器采集水样，用采泥器采集泥样。 吸取1mL水样或1g泥样，分别加到盛有9mL无菌海水的试管中，混匀后制成10-2、10-3、10-4稀释液。 分别吸取0.1mL原始水样及各稀释度的水样，接入加有制霉菌素的石油琼脂基础培养基平板和添加有链霉素、四环素的石油琼脂基础培养基平板上。前者分离石油降解细菌，后者分离石油降解真菌和酵母菌。 用无菌玻璃推棒将水样均匀涂布在培养基表面。 倒置培养皿

37、，在200C条件下培养。 培养7天后，计数降解石油细菌菌数。14天后计数降解石油真菌和酵母菌菌数。同时，挑取单菌落进行各石油降解菌的纯化培养。 将分纯的个菌株，分别接种到石油盐培养液中，在200C培养10天后，观察培养液浑浊程度和液面上菌膜的厚薄，以判断各菌株利用石油进行生长的状况。 由于海洋中分布有琼脂分解菌，在分离降解石油微生物时，可能有琼脂分解菌在上述培养基上生长。为了避免可能出现的干扰，可在分离中采用石油盐硅胶平板。操作步骤不变。9.8.3.6 光合细菌的分离培养 光合细菌（Photosynthetic Bacteria，略作PSB）是一大类能进行光合作用的原核生物的总称。除蓝细菌外，

38、都能在厌氧光照条件下进行不产氧的光合作用。研究与应用的实践表明，光合细菌在高浓度有机废水处理与资源化、水产养殖的水质调控与促进健康生长、在农业生产中作为高效活性菌肥等方面，发挥着十分有益的和令人瞩目的作用。关于光合细菌的类群、形态与生理特征、在生态系统中的地位和作用等内容，请参考有关文献与专著。这里仅就光合细菌的分离、培养方法作一介绍。 光合细菌的富集培养的一般方法 分离源 光合细菌四个科红螺菌科（Rhodospirillaceae）、着色菌科（Chromatiaceae）、绿菌科（Chlorobiaceae）、绿色丝状菌科（Chloroflexaceae）的各种菌，广泛分布于地球生物圈的各处

39、。作为光合细菌的分离源 ，一般可从富营养化的湖泊、池沼、海滩、以及水田、硫黄泉、灌水土壤、和污水厂活性污泥、畜牧场水沟等厌氧或缺氧环境采样。在较深的水体，可使用采水器采取厌氧层的水。在较浅的地方，可直接用吸管吸取带底泥的水。采样的同时记录水温、pH、有无H2S气味等项内容。将采集到的水样或泥样放在厌氧、低温条件下，带回实验室进行分离。 光合细菌富集培养基 用于光合细菌富集培养用的培养基有许多配方，这里仅介绍日本星野氏推荐的基本培养基I和基本培养基II。前者适合于红螺菌科的光合细菌，后者适用于着色菌科和绿菌科的菌。 基本培养基I：KH2PO40.5g，K2HPO40.6g，(NH4)2SO41.

40、0g，MgSO47H2O0.2g，NaCl0.2g，CaCl22H2O0.05g，酵母浸出汁0.1g， 微量元素溶液（见后）1mL，生长因子溶液（见后）1mL，蒸馏水1000ml。 以上配制成的培养基pH值约6.7。 根据需要，可在上述培养基中添加一些成分，如富集的是缺少同化型硫酸还原系的菌种，则可在基本培养基I中加入0.01%硫代硫酸钠；如是海洋性菌种，可加入3%NaCl等等。另外，如分离源中含有较多的硫酸还原菌时（尤其是采自海洋的样品），为了抑制硫酸还原菌的生长，可把基本培养基I中的(NH4)2SO4、MgSO47H2O替换成NH4Cl和MgCl26H20。 含单一有机化合物的基本培养基I

41、配置方法如下： 在容积为20mL的螺口试管中，加入最终浓度为一定量（0.050.1%）的有机物。 加入基本培养基I至1/2试管的量，松松地旋上螺盖。 1210C，灭菌15分钟。 冷却后加入过滤除菌的10%抗坏血酸钠溶液0.1mL（最终浓度为0.05%），作为还原剂。 用另行灭菌的基本培养基I注满试管，旋紧螺盖。 用同样方法可配制含各种不同的单一有机化合物的基本培养基I。 基本培养基II：KH2PO4 1.0g，NH4Cl 1.0g，MgCl26H2O 0.2g，CaCl22H2O 0.05g，微量元素溶液（见后）1mL，生长因子溶液（见后）1mL，蒸馏水 1000mL，根据需要，可在该培养基中

42、加入0.1%硫代硫酸钠、3% NaCl或0.05%乙酸钠等。 含一定浓度的H2S和CO2，并有特定pH的基本培养基II的配制，可参照表55进行。 例如，要配制No.1的基本培养基II，其中含0.1%Na2S9H2O和0.2%NaHCO3，pH=6.4，具体方法如下：在螺口试管（容积为20mL）中加入半管量的基本培养基II，松松地旋上螺盖。1210C，灭菌15分钟。冷却后依次加入0.3mL1NHCl、0.5mL8%的NaHCO3溶液（过滤除菌）和1.0mL2%的Na2S9H2O溶液（高压灭菌）。用另行灭菌的基本培养基II注满试管，旋紧螺盖。用同样方法可配制含所需H2S浓度和pH值的各种基本培养基

43、II。将制得的装有培养基的试管充分振荡后，在冷暗处放置1昼夜，使培养基内完全呈厌氧状态。在这种状态下可保存1个月左右。表55 各种基本培养基II的配制方法培养基编号培养基中的浓度（%）*最终培养基20mL中应加入的mL数培养基的pHNaHCO3Na2S9H201NHCl1NaOH10.20.10.36.420.20.10.26.730.20.10.156.940.20.10.17.150.20.10.057.360.20.17.670.20.10.057.980.20.050.156.690.20.050.16.9100.20.050.057.0110.20.057.2120.20.050.0

44、57.5130.20.050.157.8140.20.0250.056.9150.20.0257.1160.20.0250.057.3170.20.0250.17.5180.20.0250.157.9 * 最终培养基量20mL中，加入8%NaHCO3溶液0.5mL时，其最终浓度为0.2%；若分别加入2%Na2S9H2O溶液1.0、0.5、0.25mL，它们的最终浓度分别为0.1%、0.05%、0.025%。 微量元素溶液：EDTA-2Na 2000mg， FeSO47H2O 2000mg， H3BO3 100mg，CoCl26H2O 100mg，ZnCl2 100mg， MnCl24H2O 1

45、00mg，Na2MoO42H2O 20mg，NiCl26H2O 20mg，CuCl22H2O 10mg， Na2SeO3 1mg， 蒸馏水 1000mL，保存于暗处。 生长因子溶液：维生素B1 50mg， 烟酸（维生素PP） 50mg， 对氨基苯甲酸 30mg，维生素B12 5mg， 吡多酸（维生素B6） 10mg， 生物素 5mg，蒸馏水 100mL， 保存于冷暗处。 接种 适当的接种量对于有效地富集到目标菌种十分重要。因为过多的接种量会使培养基条件发生变化，导致富集培养失败。合适的接种量为：20mL富集培养基中加入分离用样品12滴。 培养 接种后的富集培养管，一般先在室内暗处放置数小时至1

46、昼夜，然后移至光照下开始光合成培养。培养时间因条件而异，大约需要1星期至1个月。如果一次富集培养光合细菌尚未充分生长，则应继续进行富集培养。即把上一次的富集培养物移接少量至无菌的富集培养液中，重复上述的培养过程，直至获得有光合细菌大量生长的富集培养物。 光源 进行光合成培养时使用的光源，以白炽灯为好。因为与荧光灯相比，白炽灯不仅发出光合细菌的类胡萝卜素吸收的短波光（450550nm），而且大量发出细菌叶绿素（Bchl）吸收的长波光（7151050nm）。 由于不同的光合细菌菌种所含有的细菌叶绿素种类不同（见表56），因此也可利用特定波长的光源来进行相应菌种的富集培养（van Niel，1971

47、）。 光合成培养的合适光照强度为5002000Lux，把培养管放在距白炽灯（4060W）1550cm处即可。另外，由于白炽灯会发出大量的热，故因注意培养装置内温度的控制。表56 各种Bchl及其主要吸收光波Bchl最大吸收波长（nm）Bchl a830890Bchl b10151035Bchl c745760Bchl d725745Bchl e715725 防止藻类生长 富集培养中若有藻类生长，会因其光合产氧而使培养基内呈好氧状态，从而引起光合细菌的生长受抑制。为了阻止藻类的生长，Swoager和Lindstrom（1971）提出可在培养基中加入光化学反应系II的抑制剂。另外，也可利用滤波器得

48、到波长700nm以上的光作为光源，在这样的光照条件下，光合细菌因含有Bchl（吸收波长为700nm以上）而能够生长，藻类则因所含Chl的吸收波长为700nm以下而不能生长。（2）各科光合细菌的富集培养 .红螺菌科（Rhodospirillaceae）光合细菌的富集培养该科光合细菌包括4属17种1亚种。这些菌种都能利用有机物作为碳源和光合成反应的氢供体进行生长。因此，红螺菌科的菌可用含单一有机物的基本培养基I，并在20300C，10002000Lux 条件下进行富集培养。培养物因菌种不同而呈现红、紫、茶色等色泽。为富集红螺菌科中的特定菌种，一般的方法是依据该菌种对某种有机物的特异利用性，配制成以

49、该有机物为单一碳源的培养基进行富集培养。此外，可利用不同菌种对培养基pH、生长因子以及光源波长范围的不同要求，来对特定菌种进行富集培养。实际应用时，常根据需要把上述培养基和培养条件组合起来，将能更有效地富集到所需的特定菌种。 以下就几种红螺菌科细菌的富集培养法作一简要介绍。 aRhodobacter sphaeroides（球形红菌）（原为Rhodopseudemonas sphaeroides，球形红假单胞菌）的富集培养： 首先，在含有0.1%乙醇或醋酸钠的培养基中进行第一次富集培养。然后，将一部分富集培养物接种到含0.1%酒石酸钠的培养基中，进行第二次富集培养。用此法可选择性地富集到球形红

50、菌（R. Sphaeroides）（van Niel，1971）。但是，在R. Sphaeroides中也有些菌株不能利用酒石酸钠为碳源。据星野氏的研究，对这些菌株的富集培养可在含3%NaCl的苹果酸钠培养基中进行。 bRhodopseudomonas acidophila（嗜酸红假单胞菌）的富集培养： 根据Pfennig（1969）的研究，可采用不含生长因子的琥珀酸钠培养基（pH=5.1）进行嗜酸红假单胞菌的富集培养。 cRhodopseudomonas viridis（绿色红假单胞菌）的富集培养： 采用乙醇或醋酸钠培养基，并利用该菌含Bchl b而以红外滤色器获得1000-1050nm波长

51、的光进行照射，可有效地富集到绿色红假单胞菌。其培养物呈绿色。（Drews and Giesbrecht，1966） dRhodospirillum fulvum（黄褐红螺菌）的富集培养： 采用只含对-氨基苯甲酸为生长因子的0.05%苯甲酸钠培养基，可有效地富集黄褐红螺菌。（Pfennig，Eimhjellen and Liaaen，1965） 着色菌科（Chromatiaceae）光合细菌的富集培养法 该科光合细菌包括10属27种。该科菌种在以CO2为碳源、H2S为光合反应氢供体的碱性培养基中生长良好。因此，可采用基本培养基II No.5或No.11，并在15300C，5002000Lux条件

52、下，对该科光合细菌进行富集培养，其培养物呈红、紫等颜色。 尽管着色菌科的各菌种，都能在上述同样的培养基和培养条件下生长，但还是能够通过适当改变培养条件，如改变培养基的pH、H2S浓度、维生素B12的有无、光强度或培养温度的改变等，来富集一些特定的菌种。研究表明，高浓度H2S（0.10.2%Na2S9H2O）和强光照（10002000Lux）条件，可用于Chromatium（着色菌属）、Thiospirillum（硫螺旋菌属）、Thiocapsa（荚硫菌属）和Thiocystis（囊硫菌属）等的富集培养。而低浓度H2S（0.05%Na2S9H2O）、弱光照强度（200500Lux）以及低温（10200C）条件，可用于Lamprocystis（闪囊菌属）、Amoebobacter（可变杆菌属）和Thiodictyon（网硫菌属）等具有气胞的菌种的富集培养（Pfennig，1967）。 在上述培养基和培养条件下进行着色菌科光合细菌的富集培养时，往往在培养基中会出现绿菌科（Chlorob