高效液相色谱法分离大豆蛋白肽

1、第22卷第2期齐齐哈尔大学学报Vol.22,No.22006年3月JournalofQiqiharUniversityMarch,2006高效液相色谱法分离大豆蛋白肽*卢鹤郑永杰 摘要采用超滤以及凝胶过滤色谱法(SephadexG15分离出分子量1000以下的小肽并收集,将收集到的不同功能性目标肽段在最佳色谱条件下进行分离高效液相色谱凝胶过滤中图分类号A文章编号 分离 相对分子质量低于1000的肽类混合物700范围内无机盐等成分 原有的肽类也不断被发现具有新的生物功能分析和制备多肽 本文采用反相高效液相色谱建立了大豆肽的RP-HPLC的分离分析方法1实验部分1.1仪器与试剂仪器包括:P230高

2、压恒流泵EChrom98色谱工作站5um,250mm HISH水浴振荡器 BS110S型电子天平722光 栅分光光度计 试剂与样品Alcalase碱性蛋白酶葡聚糖凝胶G15(上海亚东核级树脂有限公司分析纯分析纯 天津科密欧科技有限公司 1.2实验步骤1.2.1酶水解实验1.2.1.1酶水解反应配制底物浓度为6%预处理10min后 然后以加酶用量为50mL/kg 加入Alcalase碱性内切蛋白酶0.1的范围内 1.2.1.2超滤分离收稿日期 黑龙江省自然科学基金项目 卢鹤分析化学2004级研究生 分别获得分子量在>20000 10000 1.2.1.3凝胶过滤分离将6000以下的肽通过S

3、epHadexG15进行分离收集分子量1000以下的肽段 取一定浓度的小肽样品溶液进样至已用流动相A液乙腈+0.1%TFA(V/V/%B液需超声脱气后使用然后再用相应浓度的A液使柱平衡通常使用含TFA的水和乙腈为流动相梯度变化速率对色谱峰形和分离度有较大影响3 为下一步采用梯度洗脱提供依据每次增加10%每次减少10%水=10 50时的分离谱图如图1所示 水=10水=50 进一步设计采用不同的梯度洗脱条件进行分离具体实验条件为0.1到乙腈: TFA=100:0.1,梯度方式为凸形梯度图2样品在凸形梯度下的分离谱图从采用恒洗方式的各个谱图中可以看出分别考察凹形梯度其中凸形梯度洗脱方式得到的组分第2

4、期高效液相色谱法分离大豆蛋白肽2.2流动相中TFA浓度对分离的影响TFA是RP-HPLC分离蛋白质和肽类组分时最常用的缓冲试剂和离子对试剂 同时可以使键合硅胶填料表面残留硅羟基质子化TFA易挥发随流动相中TFA含量增加TFA含量为0时 由于TFA酸性较强降低色谱柱寿命分辨率 1 在分离梯度模式选择时每次增加10%每次减少10%进一步设计采用不同的梯度洗脱条件进行分离具体实验条件为0.1到乙腈:TFA=100:0.1,梯度方式为凸形梯度 80min;进样量为1ml/min该法分辩率高 为下一步大量制备和液相色谱质谱联用测序提供了依据 AGUI L ARMI,H EARNMTW phasehighRe solutionofinsulinvariantsJ61bynarrow phaseMonitoringofrecombinanthumaninsulinproduction high performanceca