分子生物学讨论——RUNX2基因对恒牙萌出的影响

1、- 2 - 摘 要恒牙萌出过迟又称恒牙迟萌，恒牙迟萌影响患者的咀嚼、发音、美观，甚至会对患者造成心理负担，显著 妨碍患者身心健康，影响患者的生活质量。而颅骨锁骨发育不全（CCD）在基因异常所致多数恒牙迟萌中最常见。CCD 是一种遗传性的骨骼系统疾病，也有散发病例报道。典型的临床表现包括前囟闭合延缓或不闭合、锁骨发育不良和恒牙迟萌、多生牙等。研究发现 Runx2 基因为 CCD 致病基因。- 3 - 目录01 02 03 - 4 - 牙齿萌出过迟又称牙齿迟萌，是牙齿萌出显著晚于正常萌出期。可发生于全部乳、恒牙或部分/个别牙。牙齿萌出过程对颅面部的正常发育有较大的影响。而且，牙齿迟萌常常会是局部或

2、全身疾病初始甚至唯一的临床表现。目前有关牙齿迟萌发病机制的研究主要集中在三个方面：局部因素、全身因素和遗传因素。牙齿萌出过迟- 5 - - 6 - 颅骨锁骨发育不全综合征，即CCD，是一种常染色体显性遗传导致的骨骼系统疾病。CCD典型的临床表现包括前囟闭合延缓或不闭合、锁骨发育不良和口腔异常表现。 牙齿异常是CCD的典型临床表现之一，可表现为乳牙滞留、恒牙迟萌以及多生牙。患者恒牙牙根发育延迟且萌出潜力减弱。大量研究证实，Runx2基因为CCD的致病基因。Runx2基因共有8个外显子，目前除了外显子0、6之外在其他外显子均已发现存在突变位点。现已发现的基因突变有上百种，包括缺失、插入、无义、错义

3、突变以及剪接位点改变等各种类型的突变。颅骨锁骨发育不全综合征- 7 - Runx2（又称 CBFA1、PEBP2A1、AML3）基因是runt结构域基因家族的一员。Runx2基因全长220kb，共包含八个外显子。Runx2基因编码转录因子RUNX2蛋白。RUNX2 是一个成骨特异性的转录因子，是成骨细胞发生与分化的必要因素。在分化完全的细胞内也可以发现 RUNX2 存在，这说明RUNX2在维持细胞的正常功能中也起着重要作用。Runx2基因RUNX2是牙齿形成的必须因素。Runx2基因突变可以引起CCD。动物研究也证实了这一点。Runx2基因敲除小鼠会表现出与CCD相似的骨骼发育异常。CCD患者

4、的牙齿异常可能是牙齿发育形成相关细胞的RUNX2功能障碍的直接结果。这提示RUNX2在牙列形成中起到非常重要的作用。RUNX2 蛋白能与CBF形成异二聚体。CBF是RUNX2维持有效功能所必须的，它可以使RHD处的RUNX结构发生变构而加强与DNA的结合能力。此外，CBF在维持RUNX的稳定中也发挥重要作用。它可以保护RUNX蛋白免受泛素-蛋白酶系统的降解。- 8 - Runx2存在多个亚型。RUNX2有两种主要的N末端亚型。这两种亚型从Runx2基因转录时分别受近端和远端启动子的调节。近端启动子的产物以氨基酸MRIPVD为起始，称为型、PEBP2A 或 P56。远端启动子的产物是以MASNS

5、L开头，称为型、Til-1 或 P57。OSF2（型）是型的剪接变体，仅出现在小鼠。型起始氨基酸为MLHSPH，并且其功能与型相似。型并不是转录活化所必须的，但可能在转录调节中有特殊的作用。RUNX2 亚型- 9 - 型和型功能不同，但都是骨发育的必要因素。型表达较广泛，不仅存在于间充质组织中，也存在于成骨细胞的祖细胞。型主要在细胞分化中发挥作用而且其表达不受细胞分化状态的影响。型可能参与了膜内成骨的起始阶段并且持续发挥作用直到成骨细胞分化结束。型在成骨细胞分化或BMP2刺激时表达增加，这提示型是维持成骨细胞表型所必须的，而型主要是起调节作用。型主要存在于前体成骨细胞和成骨细胞中，参与分化后期

6、成骨细胞的成熟。在成骨细胞分化后期型、型的表达及作用差异不大。RUNX2 亚型不同组织各亚型表达有所差别。新生小鼠切牙成釉细胞和成牙本质细胞型高表达，型和型低表达。研究显示型和型是牙胚蕾状期发育必不可少的。而且型和型是培养的小鼠下颌骨中DMP1、DSPP、AMGN和AMBN转录的必须因素，在成釉细胞和成牙本质细胞分化中起重要作用。- 10 - RUNX2 蛋白含有3个转录激活区（AD）和1个转录抑制区（RD）。AD1由N末端的19个氨基酸所组成。AD2位于谷氨酰胺/丙氨酸残基组成的Q/A域内。AD2的功能主要取决于Q/A域内的29个串连的谷氨酰胺残基，而不会受到丙氨酸残基缺失的影响。串连的氨基

7、酸残基存在抑制功能并且在核定位中发挥作用。AD3在N末端的富含脯氨酸/丝氨酸/苏氨酸的PST结构域内。该区域的突变会导致RUNX2无法SMADs产生相互作用，降低成骨细胞对TGF-/BMP信号途径的反应。此外该区域可以和p300分子相互作用影响成骨素基因的表达。p300的乙酰转移酶活性可以保护RUNX2不受SMADs泛素调节因子介导的泛素化作用降解以及促进RUNX2的转录活性。RUNX2 结构域RUNX2的Runt结构域可以与靶基因的核心结合因子位点结合。核心结合因子又称成骨细胞特异性顺式作用元2（OSE2）。OSE2被发现存在于所有主要的成骨相关基因，如骨钙素、型胶原、BSP、骨桥蛋白、MM

8、P-13 及 ALP 这些基因的启动子区域。OSE2 与其他因素如 AP-1 及 SMADs共同控制这些基因的表达。- 11 - RD位于PST结构域的C末端。C末端的5个氨基酸序列(VWRPY)高度保守并可能与TLE或Grg家族的阻遏蛋白结合而阻遏转录作用。成骨细胞分化期间TLE/Grg表达的下调可以缓解细胞分化时Runx2的抑制作用。RD的其他部分也可以和别的阻遏蛋白作用，如HDAC、SIN3 及YAP等。RUNX2在转录后会与核基质的特殊区域结合而作用于转录控制以及RUNX2与SMADs、RNA聚合酶等的相互作用。RUNX2的这一作用受核基质定位信号(NMTS)调节。NMTS是位于RHD

9、和PST之间，由28个氨基酸所组成的片段。NMTS区域的点突变会影响RUNX2在核内的定位，进而影响RUNX2与目的基因之间的相互作用。RUNX2 结构域- 12 - Runx2基因与骨组织- 13 - Runx2 基因敲除小鼠软骨发育正常，但是没有骨组织形成，也没有成骨 细胞及破骨细胞生成，软骨细胞成熟也受到干扰。这些发现都表明了转录因子RUNX2是成骨细胞分化所必须的。 Runx2与成骨细胞分化- 14 - RUNX2和牙齿成熟及萌出- 15 - Runx2 的表达控制影响成釉器上皮发育的下游因素。AMBN 是一种细胞外基质蛋白，它在釉质结晶形成中有一定的作用。鼠 Ambn 基因的启动子包

10、含有两处 RUNX2 结合位点。RUNX2 可与 Ambn 启动子重要的功能性区域结合。Ambn 启动子 RUNX2 结合位点的基因突变会使启动子活性降低。说明 RUNX2 在 Ambn 基因转录中发挥重要作用。型 Runx2 的 mRNA在幼稚及成熟成釉细胞内仍有强烈表达。因此，Runx2 参与成釉器形成早期阶段和牙冠形成，并且可能在牙釉质形成也起直接作用。CCD 患者拔除恒牙的组织学研究显示牙齿发育不全，而乳牙并无此发现。成釉细胞- 16 - 成骨细胞与成牙本质细胞有一些相似之处，包括类似基因的表达。成牙本质细胞细胞外基质（DSPP 或 DMP1）的非胶原成分也存在于其他组织，如成骨细胞和

11、牙周组织，只是表达水平较低。Runx2 在早期成牙本质细胞表达上调。然而与成骨细胞不同的是，分化成熟的成牙本质细胞 Runx2 显著降低甚至检测不到。此外，小鼠 Dspp 基因调控子中存在多处 RUNX2 结合位点。RUNX2 可以提高幼稚成牙本质细胞Dspp 的表达，下调较成熟成牙本质细胞 Dspp 表达。成牙本质细胞- 17 - 细胞牙骨质内的多数细胞均有不同程度的Runx2基因mRNA和RUNX2 蛋白的表达。CCD 患者恒牙的无细胞和细胞牙骨质均存在缺陷，而乳牙并不受影响。牙骨质- 18 - 牙周膜（PDL）成纤维细胞存在型 Runx2 的表达。RUNX2通过抑制作用来维持PDL的宽度

12、。PDL成骨细胞的形变会引起RUNX2表达增加，及活化ERK/MAPK信号途径，提高RUNX2的DNA结合活性。牙周膜- 19 - RUNX2控制成骨细胞和成牙本质细胞的成熟，因而，在RUNX2蛋白缺乏组织中牙齿萌出迟缓，CCD患者的牙齿成熟比正常人延迟四年。在牙齿发育及萌出的整个过程中牙槽骨中都有RUNX2的表达。牙齿萌出受破骨细胞、成骨细胞的精确控制。受RANK-RANKL调节的牙槽骨破骨细胞生成是正常牙齿发育及萌出的必须因素。而CSF-1、RANKL和OPG的空间分布及相对丰度是决定牙齿周围骨质中破骨细胞活性的关键因素。证据显示RUNX2可以直接或间接的作用于OPGRANKRANKL系统

13、来影响骨重建过程，这种作用在牙胚和骨形成或吸收的细胞之间同步发生，以保证牙齿在颌骨内正确的空间位置。而CCD患者牙齿迟萌及异位萌出或许是因为RUNX2功能丧失所致。- 20 - 牙齿的萌出还依赖于牙囊的存在。研究表明，以手术方法去除小鼠的牙囊，牙齿不能萌出，而保留牙囊用其它惰性物质置换牙胚，结果置换物仍可以萌出。说明缺乏牙囊的牙齿不能正常萌出。其次，牙囊还可以分泌集落刺激因子(CSF1)、单核细胞趋化蛋白(MCP-I)、白介素-la(IL-1a)、上皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)等，从而诱导单核细胞从牙囊组织毛细血管中进入牙囊，然后进一步转移至牙槽骨中成为破骨细胞。牙囊在牙齿萌出中的作用有证据表明，