大孔树脂对三孢布拉霉菌产番茄红素的吸附性能研究_图文

1、中国生物工程杂志China B i otechnol ogy,2010,30(4:71276大孔树脂对三孢布拉霉菌产番茄红素的吸附性能研究李干禄吴启赐武振军石楠万红贵3(南京工业大学生物与制药工程学院南京210009摘要为利用大孔吸附树脂分离纯化三孢布拉霉菌发酵液番茄红素,考察了4种大孔树脂(HP20,HP2MG,SP825,SP207对番茄红素的吸附2解吸特性,筛选出最佳树脂。结果表明,HP20大孔树脂对番茄红素具有较好的吸附2解吸性能,且吸附迅速,能在1h 内达到吸附平衡。用含55%和60%异丙醇的丙酮不连续梯度洗脱,回收率可达89.55%,重结晶后可获得纯度95%以上的番茄红素,经红外、

2、质谱、核磁等鉴定为天然型番茄红素。该方法简单,可操作性强,极具工业应用价值。关键词三孢布拉霉菌番茄红素大孔树脂不连续梯度洗脱中图分类号Q819收稿日期:2009212216修回日期:20102022263通讯作者,电子信箱:hg_wansina .com番茄红素(Lycopene 又名番茄烃,是一种具有11个共轭双键的不饱和脂溶性天然色素,分子式C 40H 56,分子量536.9,化学结构上属于类胡萝卜素。在所有的类胡萝卜素中,番茄红素对单线氧的消除能力最强,是2胡萝卜素的两倍,抗氧化作用也明显优于2胡萝卜素,同时还具有清除自由基、诱导细胞分化、减少DNA 损伤等作用122,故其在消除氧自由基

3、、降低癌症发病率、增强人体免疫功能以及防治心脑血管疾病方面具有良好的应用前景3。目前国内应用的番茄红素主要从天然番茄中提取,番茄中番茄红素的最高含量仅有140200mg/kg,且成本较高、纯化工艺复杂。微生物发酵法生产具有成本低、污染小、生产周期短及工艺简单等优势,是番茄红素工业化生产的趋势。番茄红素的纯化方法主要有大孔树脂吸附法、重结晶法和柱层析法等。大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物,是吸附作用和筛选作用相结合的分离材料,在天然食用色素等方面已有应用4。本文对微生物发酵产番茄红素进行分离提取及纯化,研究和探讨了大孔树脂法分离纯化番茄红色素的影响因素,包括树脂、解吸剂

4、种类和洗脱方式等,为工业化生产番茄红素奠定基础。1材料与方法1.1材料与试剂菌丝体为本实验室发酵所得;大孔树脂HP20、HP2MG 、SP207、SP825(北京绿百草公司;甲醇、四氢呋喃为色谱纯;丙酮、正己烷、石油醚、异丙醇等均为分析纯。1.2仪器高效液相色谱仪为A lltech 2000,色谱柱为A llti m a C18,5,250mm ×4.6mm;番茄红素标准品(Sig ma 公司;恒温振荡器DSHZ 2300A (太仓实验设备厂;玻璃层析柱:15mm ×300mm (上海锦华;B ruker AV 400MHz 傅立叶变换NMR 仪(瑞士B ruker 公司。

5、1.3实验方法1.3.1番茄红素粗提液制备三孢布拉霉菌发酵液经真空抽滤后,乙醇洗涤,干燥即得到干菌丝体。将菌丝体球磨破壁,再经正己烷/丙酮混合液连续提取,提取液经真空浓缩后用适量丙酮溶解,制备成浓缩液,-20保存备用。1.3.2番茄红素的含量测定色谱柱为Alltech Allti m aC18,5,250mm ×4.6mm,色谱流动相为甲醇四氢呋喃水=66304,检测波长472nm ,进样量20l,流速1.5m l/m in,柱温30。样品经适当稀释后进样,在此条件下番茄红素标准品在13m in 左右出峰。该标准曲中国生物工程杂志China B i otechnol ogy Vol.

6、30No.42010线方程为Y=1.32×108X-1.81×105,r=0.9999,线性范围0.0720.36g/m l。1.3.3大孔树脂预处理大孔树脂一般含有未聚合的单体、致孔剂、引发剂及其分解物、分散剂和防腐剂等脂溶性杂质,使用前应先预处理。先用无水乙醇浸泡24h,充分溶胀;无水乙醇淋洗,至洗出液加适量水无白色浑浊现象为止;蒸馏水洗至无醇,过滤,室温下晾干备用。1.3.4静态吸附解析实验各大孔树脂吸附前用丙酮平衡2h后,准确量取各树脂2.00m l置于10m l具塞玻璃试管中,再加入200g/m l番茄红素浓缩液,盖紧瓶塞,二者体积比为11.5,避光振荡吸附4h(

7、25、120r/m in,用丙酮洗涤,再用异丙醇解吸。取样测定各种树脂吸附后的上清液、洗涤液和解吸液番茄红素含量,比较各树脂的静态吸附率与解吸率,筛选出最适合吸附番茄红素的树脂。原样品中番茄红素含量与上清液,洗涤液和树脂吸附量呈质量平衡关系,用如下公式计算吸附量(mg/m l树脂、吸附率(%、解吸率(%、总回收率(%。QT (mg/m l=(C-Cs-CwV×VA(1(%=(C-Cs-CwC0×100(2RD (%=CEC0-C S-C w×100(3RT (%=CEC0×100(4式中:QT吸附量(mg/ml湿树脂;吸附率(%;RD 解吸率(%、RT总

8、回收率(%;C原样品初始浓度(g/ml、CS上清液浓度(g/ml、C W洗涤液浓度(g/ml、C E解吸液浓度(g/ ml;V树脂体积(ml、V A吸附液体积(ml。1.3.5吸附时间的确定25时,根据1.3.4节的结果,称取一定量的树脂HP20,平衡后装柱吸附,树脂体积与番茄红素浓缩液体积比为11.5,避光水浴振荡吸附(25、120r/m in,15m in、30m in、45m in、60m in、120m in、180m in、240m in、300m in、360m in时分别取样,绘制吸附动力学曲线。1.3.6解吸溶剂的确定25时,分别用相同浓度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇以及异丙

9、醇/丙酮(体积比为11对吸附了番茄红素的大孔树脂解吸,测定解吸液的番茄红素含量,比较解吸效果。1.3.7洗脱方式的选择25时,将树脂HP20置于吸附柱中,用丙酮以0.5m l/m in的流速平衡树脂3h后,以同样流速加入适量番茄红素浓缩液吸附至平衡,再用丙酮洗涤。在一定时间内,用含40%90%异丙醇的丙酮对吸附了色素的树脂进行线性梯度洗脱,流速为0.5m l/m in;同时做平行试验,用55%和65%异丙醇的丙酮不连续梯度洗脱,比较二者洗脱效果。1.3.8穿透曲线特性研究25时,将树脂HP20置于吸附柱中,加入适量番茄红素浓缩液,洗脱剂以0.5m l/m in的速度流过吸附柱,分段收集流出液,

10、每次取样2m l检测番茄红素含量,共收集24份,以洗脱液番茄红素含量(g/m l对洗脱液总体积(m l绘图拟合得穿透曲线图。2结果与讨论2.1大孔树脂的筛选树脂吸附量的大小是吸附分离提取法的关键,一般来说极性物质在非极性介质中易被极性吸附剂吸附,非极性物质在极性介质中易被非极性吸附剂吸附。番茄红素是一种非极性长链烯烃,所以考察4种中低极性树脂HP20、HP2MG、SP207和SP825对番茄红素的吸附特性。结果如表1,4种树脂对番茄红素均具有很强的吸附能力,大小顺序为SP825>HP20>SP207> HP2MG。由于SP825比表面积大,所以吸附率最高,为99.55%,但孔

11、径较小,解吸则最为困难。HP20孔径大、比表面积小,吸附率相对SP825较低,但解吸效果最好,其解吸率为81.86%。综合考虑树脂的吸附能力和番茄红素的解吸情况,本文选择树脂HP20作为吸附分离番茄红素的树脂。表14种吸附树脂对番茄红素的吸附2解吸特性Table1St a ti c adsorpti on2desorpti on properti es of4resi n s树脂型号极性平均孔径(n m比表面积(m2/g原样品(g/ml上清液(g/ml洗涤液(g/ml洗脱液(g/ml吸附率(%解吸率(% SP825小571000200 1.60.3117.899.0559.17 SP207小1

12、05630200 2.50.6140.298.4571.20 HP20小260600200 2.40.3161.698.781.86 HP2MG中170470200 4.90.7149.397.276.80 272010,30(4李干禄等:大孔树脂对三孢布拉霉菌产番茄红素的吸附性能研究 2.2静态吸附时间的确定吸附动力学主要考察有效成分的吸附量随时间的变化过程,部分反映了有效成分在树脂上的吸附过程。通过吸附动力学实验可预测树脂吸附达到平衡所需时间及树脂对有效成分的吸附速率。因此,吸附速度亦是树脂吸附性能的重要参考指标。图1为树脂HP20对番茄红素的静态吸附动力学曲线,在30m in 前树脂HP

13、20对番茄红素的吸附较快,1h 后树脂对番茄红素的吸附量趋于稳定,随着时间的延长,番茄红素的吸附量呈下降趋势,主要原因是番茄红素与空气接触被氧化的结果。因此,本文选择番茄红素的静态吸附时间为1h 。 图1静态吸附动力学曲线F i g .1St a ti c adsorpti on k i n eti cs curveof HP20resi n a t 252.3解吸溶剂的确定解吸剂必须具备两个基本条件:首先,该溶剂应能使大孔树脂吸附溶胀;其次,该溶剂应容易溶解吸附物。用间断称重法5考察了4种溶剂浸泡下树脂HP20的溶胀行为,发现树脂在乙酸乙酯中的溶胀能力最差,如图2。又据报道,番茄红素在有机溶

14、剂中的溶解度顺序为:乙酸乙酯>丙酮>异丙醇>无水乙醇6,由此可见,丙酮同时具有使树脂溶胀和溶解番茄红素的能力,解吸效果最好。实际应用中混合溶剂的使用效果要优于单一溶剂,对其进行追加实验,发现异丙醇/丙酮(11,v:v 混合溶剂的解吸效果明显优于丙酮和异丙醇,结果见表2。因此本文选择异丙醇/丙酮(11,v:v 混合溶剂作为树脂HP20的解吸剂。图2不同溶剂中树脂HP20的溶胀曲线F i g .2Swelli n g curve of HP20ma tr i x i nd i fferen t solven ts表2不同洗脱液中番茄红素含量(g /m lTable 2L ycop

15、ene concen tra ti on i n d i fferen teluen ts(g /m l时间(m in 乙醇丙酮乙酸乙酯异丙醇异丙醇:丙酮(11,v:v 3041.155.425.049.374.86049.663.933.958.785.29053.870.340.665.290.912059.576.346.568.892.72.4洗脱方式的选择由表3可以看出,采用含40%90%异丙醇的丙酮线性梯度法洗脱,该树脂对番茄红素的吸附率和解吸率分别是97.7%和89.4%,异丙醇在混合溶剂中40%70%的比例范围内番茄红素基本被洗脱。用55%和65%异丙醇的丙酮不连续梯度洗脱进行

16、对照,结果见表4,其吸附率和解吸率都提高了 1.15%和1.19%,回收率也提高到89.55%。考虑到生产工艺的简洁性和可行性,本文选择含55%和65%异丙醇的丙酮液不连续梯度洗脱番茄红素。表3线性梯度洗脱对番茄红素洗脱的影响Table 3Eluti on stud i es usi n g li n ear grad i en t m ethod for pur i f i ca ti on of lycopene 组分原样品洗涤液洗脱液异丙醇/丙酮(异丙醇比例,%405060708090番茄红素含量(g/m l 200 4.6174.721.883.441.7吸附率(%

17、97.7解吸率(%89.40总回收率(%87.3537中国生物工程杂志China B i otechnol ogyVol .30No .42010表4不连续梯度洗脱对番茄红素洗脱的影响Table 4Eluti on stud i es usi n g step grad i en t m ethod for pur i f i ca ti on of lycopene 组分性质原样品洗涤液洗脱液异丙醇/丙酮(异丙醇比例,%5565番茄红素含量(g/m l 200 2.3179.1113.365.8吸附率(%98.85解吸率(%90.59总回收率(%89.55 2.5穿透曲线特性穿透曲线在研究色

18、谱的质量传递效应和测定柱子的穿透容量(即动态吸附量方面有很重要的作用,通过曲线可以了解实际工况下吸附质从流动相到吸附相的质量传递概况以及理论塔板当量高度(HETP 。理论塔板数N 和理论塔板当量高度H 可以等效地用来描述柱效率,H 值为1cm 表明该树脂已有很好的柱效。树脂HP20的穿透曲线如图3所示,流出体积42m l 时开始完全穿透,该树脂不再吸附番茄红素,此时浓度为47.1g/m l 。通过计算树脂的动态吸附量为90.38g/m l 湿树脂,理论塔板当量高度HETP 值0.31,理论塔板数N 32.09,表现出了较好的反相色谱分离性能。 图3树脂HP20吸附番茄红素的穿透曲线F i g

19、.3Breakthrough curve for lycopene usi n gHP20resi n a t 252.6性质鉴定纯化组分采用低温结晶,真空干燥至恒重,所得番茄红素晶体经乙酸乙酯溶解后于无水乙醇中重结晶。对所得晶体进行红外、质谱与核磁鉴定,分析如下:2.6.1红外光谱取番茄红素晶体,采用溴化钾压片法进行红外光谱检测,其结果如图4所示。由图4可以看出,番茄红素晶体样品表现为典型的共轭多烯结构,波数3035cm 21为2CH 3的特征伸缩振动峰。波数2920,2850cm 21为2CH 22的特征伸缩振动峰。波数1653,1634,1558cm 21为2C =C 2的特征伸缩振动峰

20、。波数957cm21为反式单烯双取代的C =C 振动峰。红外光谱分析结果与文献基本一致7。图4番茄红素红外光谱图(KBr 压片法F i g .4I R of lycopene (KBr squa sh m ethod2.6.2质谱岛津LC 2MS 2010A 高效液相色谱2质谱联用仪,采用APC I 电离方式,质谱图见图5、图6。图5番茄红素化学电离质谱图F i g .5APC I(+2M S of lycopene图5中,537.5为M +H +,是番茄红素分子结合了一个H +所形成的正分子离子峰。图6中,536.1为472010,30(4李干禄等:大孔树脂对三孢布拉霉菌产番茄红素的吸附性能

21、研究 图6番茄红素化学电离质谱图F i g .6APC I(22M S of lycopeneM 2H ,是番茄红素形成的负分子离子峰。由此推算样品的分子量与番茄红素分子的理论分子量536.85基本一致。2.6131H 2NMR 仪器为B ruker AV 400,溶剂为氘代氯仿。番茄红素样品的氢谱结果见图7,化学位移值见表5。经鉴定,所得晶体红外光谱分析与文献7基本一致,如图4,经APC I 源质谱检测得分子量为536.7,化学位移值与标准品有很好的相似性8,如图7和表5,结果表明制备的为天然型番茄红素。3结论对于发酵生产的番茄红素的纯化方法国内报道很少,番茄红素极易被氧化或异构化的性质也使

22、得它的分离纯化较为困难,成为制约发酵法生产工业化应用的一个重要因素。本文较系统地研究了大孔吸附树脂吸附纯化发酵产物中番茄红素的方法,实验结果表明,不同类型的大孔树脂对番茄红素的吸附2解析性能不同,树脂HP20对番茄红素的吸附率较高,解吸效果最好,适合于番茄红素的分离纯化。该树脂对番茄红素的吸附迅速,能在1h 内达到吸附平衡,具有很好的操作性。用55%和60%异丙醇的丙酮液不连续梯度洗脱效果较好,回收率可达89.55%。绘制穿透曲线研究其图7番茄红素样品核磁共振氢谱图F i g .71H 2N M R spectru m of lycopene特性,经计算得HETP 值和理论塔板数N 分别为0.

23、31和32.09,表现出了较好的反相色谱分离性能。影响树脂吸附分离番茄红素的因素除上述讨论的树脂种类、解吸剂的种类和洗脱方式外,还与番茄红素的吸附流速、洗脱流速、洗脱温度以及洗脱体积等诸因素有关。因此,对番茄红素的吸附分离仍需作进一步的研究。5776 中国生物工程杂志 China B iotechnology 表 5 番茄红素样品 1 H 2NM R的化学位移值 1 Vol 30 No. 4 2010 . p rostate cancer World J U rol, 2003, 21 ( 1 : 9. . 4 汪茂田 ,谢培山 ,王忠东 ,等 . 天然有机化合物提取分离与结构 质子 2, 2

24、 4, 4 7, 7 10, 10 12, 12 15, 15 17, 17 19, 19 1 Clinton S K Lycopene: chem istry, biology, and imp lications for . human health and disease. Nutr Rev, 1998, 56 ( 2 : 35. 2 B ram ley P M. Phytochem istry, 2000, 54 ( 3 : 23. 3 Pohar K S, GongM C, Bahnson R, et al Tomatoes, lycopene and . p rostate can

25、cer: a clinician guide for counseling those at risk for s Abstract The potential of m acroporous resin for separation and purification of lycopene p roduced by B. trispora were investigated. HP2M G, SP825 and SP207 were studied. The op tim al resin for lycopene was screened and selected. The results

26、 exp ressed that HP20 resin had a better adsorp tion 2desorp tion p roperty for lycopene. 1 adsorp tion balance in one hour Purification of lycopene using packed bed colum n by HP20 resin was carried out . using step gradient of 55% isop ropyl alcohol in acetone followed by 65% isop ropyl alcohol in

27、 acetone. A 89. 55% recovery of lycopene was detected by HPLC. After further recrystallisation the purity of lycopene was operate, w ith a good industrial app lication value. above 95% and the structure was confirmed by IR , M S and H 2 NMR. The whole p rocess was sim p le, easy to Key wordsB lakesl

28、ea trispora Lycopene acroporous resin Step gradient elution M Table 5 H 2NM R chem ica l sh ift va lues of the lycopene sam ple 质子 化学位移 化学位移 (文献 (测定 5. 11 2. 11 6. 49 6. 18 6. 35 6. 62 5. 14 2. 14 6. 49 6. 20 6. 36 6. 64 3, 3 6, 6 8, 8 2. 11 5. 95 6. 26 6. 64 6. 26 11, 11 14, 14 16, 16 18, 18 20, 20

29、 1. 687 1. 818 1. 968 1. 612 1. 968 1. 646 1. 939 化学位移 化学位移 (文献 (测定 2. 14 5. 97 6. 26 6. 65 6. 27 5 左榘 ,粟方星 ,朱常英 , 等 . 聚丙烯酸凝胶溶胀行为的研究 . 离 1. 720 1. 802 2. 00 6 李芳 ,孔令明 ,冯作山 . 番茄红素结晶溶剂选择的初步研究 . 食 参考文献 7 惠伯棣 . 类胡萝卜素化学及生物化学 . 北京 : 中国轻工业出版 Is lycopene beneficial to human health?. 8 Barrie Tan. Analytical and p reparative chromatography of tomato paste car