固相萃取-反相高效液相色谱法测定鲜肉中盐酸克伦特罗残留量的条

1、固相萃取-反相高效液相色谱法测定鲜肉中盐酸克伦特罗残留量的条件优化张群,刘烨(湖南省食品测试分析中心,湖南 长沙 410125摘要:本文对固相萃取-反相高效液相色谱法测定鲜肉中的盐酸克伦特罗的前处理方法和色谱条件进行了优化。超声提取时间从20 min 延长到30 min ,采用固相萃取柱过柱净化,过柱速度为1d/s 。其色谱条件为V 甲醇:V 0.02mol/l 磷酸二氢钠(pH6.0=40:60,固定相ODS-C18,柱子4.6 m ×150 mm ,流速0.8 mL/min ,检测波长210 nm 。优化试验条件后盐酸克伦特罗残留量含量回收率得到较大改善,准确性高,残留回收好,重

2、现性佳。关键词:固相萃取-反相高效液相色谱法;测定;盐酸克伦特罗中图分类号:TS207.5;文献标识码:A ;文章篇号:1673-9078(200903-0337-04Optimization of Detection of Clenbuterol Residue in Rresh Meat by Solid Phase Extraction-HPLC MethodZHANG Qun, LIU Y e(Food test and analysis center of Hunan province, Changsha 410125, China Abstract: In this paper,

3、solid-phase extraction - RP-HPLC was applied for the detection of clenbuterol residue in fresh meat and both the pre-treatment method and chromatographic conditions were optimized. For the pre-treatment of the meat samples, the best ultrasonic extraction time and elution speed of the extracts on sol

4、id phase were 20-30 min and 1d/s, respectively. Then the purified extracts was analyzed by RP-HPLC on a ODS-C18 column (4.6 m ×150 mm using 0.02 mol/L of solium dihydrogen phosphate solution (pH6-methanol (40:60 as mobile phase at a flow rate of 0.8mL/min and a UV detector at 210nm. This method

5、 for clenbuterol residue detection in fresh meat had high accuracy, residual recovery, and good reproducibility.Key words: solid-phase extraction; RP- HPLC detection; clenbuterol residues盐酸克伦特罗(clenbuterol, CLB ,化学名为“2-(叔丁氨基甲基-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐”,俗称瘦肉精,为白色的结晶性粉末,无臭,味略苦,在水中或乙醇中溶解,熔点为172176 。在动物体内残留时间长

6、,容易蓄积,化学性质稳定,一般的烹调加热方法不能将猪肉和脏器中残留的“瘦肉精”毒性破坏, 以致因猪肉和脏器中残留的盐酸克伦特罗超量引起的食物中毒屡有发生17,18,6。目前,国际上已经有多种技术可以对动物组织中盐酸克伦特罗进行较为灵敏的检测,主要有色谱技术,包括高效液相色谱、气相色谱、凝胶渗透色谱等;质谱与色谱联用技术,如气相色谱质谱联用技术,液相质谱联用技术;电化学技术,包括修饰电极技术、收稿日期:2008-10-06作者简介:张群(1972-,女,湖南澧县,副研究员,主要从事农产品和食品检测研究工作生物传感器技术、高效毛细管电泳等;免疫酶技术,主要是酶联免疫技术3,5,7,16,20。目前

7、,有关盐酸克伦特罗残留检测的国标方法有3种,分别为酶联免疫法(ELISA ,高效液相色谱法(HPLC 1,2,4,814和气质联机法(GC-MS 19。在日常中普遍存在残留含量回收率不高的问题,影响检验含量15。为此,笔者通过对动物性食品中克伦特罗残留量的测定GB/T 5009.192-2003运用固相萃取反相高效液相色谱法测定鲜肉中盐酸克伦特罗的残留量的前处理条件与色谱条件进行优化。 1 材料与方法1.1 仪器与试剂LC-20A T, PDA 检测器, Shimpack ODS-C18柱(0.46 m ×150 mm,Mollecular 纯水机,AutoScience 超声仪,离

8、心机,标准试剂(北京国家标准物质研究337中心提供。 1.2 分析步骤 1.2.1 提取 称取捣碎的鲜肉10 g (精确到0.01 g 于研钵中,加0.1 moL/L 高氯酸20mL ,研磨至肉中蛋白质变性,溶液变混浊,然后置于磨口玻璃离心管中,超声处理30 min ,取出置于80 水浴中加热30 min ,取出冷却后4500 r/min 离心15 min ,倾出上清液,沉淀用5 mL 0.1 mol/L 高氯酸溶液洗涤,再离心,将两次的上清液合并。用1 mol/L NaOH 溶液调节pH 值至9.5±0.1,若有沉淀产生,再4500 r/min 下离心10 min ,将上清液转移到

9、磨口玻璃管中,加入8 g NaCl ,混匀,加入25mL 异丙醇-乙酸乙酯混合液(V 异丙醇:V 乙酸乙酯=40:60,置于震荡器上震荡提取20 min 。提取完毕,放置5 min 。用吸管小心将上层有机相移至旋转蒸发瓶中,用20mL 异丙醇-乙酸乙酯混合液(V 异丙醇:V 乙酸乙酯=40:60,再重复萃取1次,合并有机相,于60 在旋转蒸发器上浓缩至近干。用1 mL 0.1 mol/L 磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.0充分溶解残留物,经针筒式微孔过滤膜过滤,洗涤三次后完全转移至5 mL 玻璃离心管中,并用0.1 mol/L 磷酸二氢钠缓冲液(pH 6.0定容至刻度。 1.2.2 净化Clean

10、ert PC ×60mg/3mL (P/N:PC ×0603,Agela Technologies (a.活化:2 mL 甲醇,2 mL 水,2 mL 30 mM HCl ; (b.上样:20 mM 的乙酸胺溶液; (c.淋洗:水,甲醇; (d.洗脱:4%氨化甲醇。过柱净化后氮气吹干,流动相定容至1.0 mL ,过0.45 m 滤膜,待用。 1.2.3 色谱分析色谱条件:色谱柱 Shimpack ODS-C18,0.46 m ×150 mm流动相:0.02 mol/L 磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0-甲醇(V /V =40/60,流速0.8 mL/min ,进样量1

11、0 L ,二极管阵列检测器,检测波长210 nm, 利用峰面积进行多点标准法定量。 2 结果与讨论2.1 检测波长的选择取适当浓度的盐酸克伦特罗标准溶液,在日本岛津SPD-M20A 二极管阵列紫外可见分光光度计于190400 nm 处对所检测的物质进行波长扫描,盐酸克伦特罗标准品的扫描特征吸收光谱在210、241和269nm 有3个峰值依次变低的吸收峰。见图1所示。考虑方法的灵敏度,线性范围和光谱干扰等因素,因此确定检测波长为210 nm 。 2.2 提取时间将提取时间延长,用研钵处理,捣碎,超声时间从20 min 到30 min ,高氯酸将肉中的盐酸克伦特罗盐彻底溶出。 图1 盐酸克伦特罗标

12、样的光谱图Fig.1 Spectrophotometry of clenbuterol standard2.3 pH 值的准确调节2.3.1 样品处理时pH 值的准确调节将分离出来的盐酸克伦特罗用1 mol/L NaOH 转化成克伦特罗进入有机相提纯时,pH 值定位要非常准确,即调节pH 值至9.5±0.1。pH 值低时盐酸克伦特罗转化成克伦特罗的反应不够彻底;pH 值高时会将不溶于有机相的其他杂质转化成为溶于有机相的物质,从而极大干扰有机相的提纯。2.3.2 有机相比例及流动相pH 值的选择有机相比例和流动相pH 值对保留时间和检测灵敏度均有较大的影响。pH 值偏大会造成峰拖尾,p

13、H 值太小又会影响柱寿命。按照GB/T 5009中测定克伦特罗中流动相采用水-甲醇(V /V =55/45,结果没有标样峰。考虑到盐酸克伦特罗是盐,不能在非极性柱上保留,随着水一起被带走,没有峰出现,将流动相中水相改为缓冲盐,用0.02 mol/L 磷酸二氢钠(pH6.0。采用三种有机相比例30%,40%,50%进行试验,选取流动相合适的比例。甲醇-缓冲盐的体积比为30/70时没有样品峰;调整流动相比例,调整到40/60出了两个峰,但需要进行样品峰的确认。当进样量为10 L, 保留时间Rt 为5.574 min ,峰面积A 为17896;进样量为20 L 时, 保留时间Rt 为5.574 mi

14、n ,峰面积A 为35539,可见进样量增大1倍,保留时间Rt 为5.574 min 的峰面积增大将近1倍,可见保留时间Rt 为5.574 min 的峰就是盐酸克伦特罗的峰;当比例调整到50/50338时,峰出现拖尾,出峰时间不太合适。结果表明:有机相体积分数为40%时,标样峰和溶剂峰能够很好分开、盐酸克伦特罗出峰时间、峰形令人满意。 339缓冲盐的pH 值也是影响分离效果好坏的重要条件。考虑到被测物质为弱酸性化合物,在弱酸性条件下可得到一定的保留,在选定的流动相体系构成比例不变的情况下,综合考虑与杂质分离和灵敏度的问题,对缓冲盐的pH 值进行优化。用H 3PO 4调0.02 mol/L 磷酸

15、二氢钠溶液的pH 值,pH 值为3,4,5,6。结果表明pH 值低于6时,出峰时间太提前,且与溶剂峰分不开;当缓冲盐的pH 值为6时,被测定物质保留时间由3.19 min 延长到5.574 min ,缓冲盐的pH6.0时标样峰和溶剂峰能够很好分开、盐酸克伦特罗出峰时间、峰形令人满意,保留时间和灵敏度均较为令人满意。 2.3.3 流速的选择流动相比例与流速的优化调节对试验分离影响极大,适宜的流动相比例和恰当的流速能够很好地将杂质峰与盐酸克伦特罗峰完全分离出来。当流动相甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氢钠(pH6.0的体积比为40/60,流速为0.8 mL/min ,杂质峰与盐酸克伦特罗完全分离

16、,保留值也最适宜,不受杂质和溶剂等干扰。流动相的流速选择实验表明,当流速为 1.0 mL/min 时,出峰快,但分离不好;流速为0.8 mL/min时,分离效果达到要求,当流速小于0.8 mL/min 时,则色谱峰扩宽,保留时间也太长。 2.3.4 固相萃取条件净化的选择固相萃取是近年来用得较广泛的样品前处理技术,它具有操作简单,试剂用量少等特点,能有效的对样品进行分离、净化和浓缩,故本文采用C18固相萃取小柱,避免了液-液萃取或水浴浓缩的繁琐,同时也降低了蛋白质等杂质的干扰。C18小柱先用甲醇、水活化,使填料能充分溶胀,湿润,便于待测物质的吸附。然后上样,加样时流速也直接影响回收率,提取液过

17、柱速度一定要控制准确。速度过快提取净化就不够完全,弱阳离子交换柱上还会残留盐酸克伦特罗;速度过慢,杂质大分子阳离子会被洗下来造成杂质过多。加样太快会导致待测定物质的流失,在本实验中控制1 d/s 的流速。 3 结果与讨论3.1 线性范围及检测限配置一系列不同稀释度的系列标准溶液,在拟定的色谱条件下进样测定,以含量C (µg/mL 为横坐标,峰面积A 为纵坐标绘制标准曲线,结果表明线性良好,回归方程,相关性和检测限,检测限以信号为3倍噪声为准。具体方程及检测限,见表1。表1 标准曲线和检测限Table 1 Calibration curve of clenbuterol content

18、 and the detection limit化合物 回归方程浓度范围/(µg/mL相关系数(R检测限/(µg/mL盐酸克伦特罗标准曲线Y=ax+b, a=6.041415e-007, b= -9.530763e-0040.01-1.0 0.9989122 0.01 表2 盐酸克伦特罗样品加标回收率及精密度 注:表1所有实验数据是三次重复实验的平均值。Table 2 Recovery rate and precision of the method本底值/(g/mL加标量/g测定均值 /(g/mL回收率/%日内RSD (%, n=61 0 0. 1 0.075 75 1.

19、52 0 0. 5 0.402 80.4 1.83 0 1 0.825 82.5 1.4 图2 标样图谱注:表2所有实验数据是三次重复实验的平均值。Fig.2 HPLC chromatogram of the clenbuterol standard3.2 方法的精密度和回收率标样图谱及样品图谱见图2图3。加标回收率和精密度见表2。结果表明:优化试验条件后盐酸克伦特罗残留量含量回收率得到较大改善,准确性高,残留回收好,重现性佳。 图3 加标样品图谱4 小结Fig.3 HPLC chromatogram of the sample added withclenbuterol standard本方

20、法与国标相比,对测定鲜肉中盐酸克伦特罗残留量的优化条件为:超声提取时间由20 min 延长到30 min ,采用固相萃取柱过柱净化,采用0.02 mol/L 磷酸二氢钠(pH6.0缓冲盐代替纯水作流动相,采用V/V(甲醇/磷酸二氢钠比例为(40/60,样品流速为0.8 mL/min,净化过柱速度1 d/s 。 参考文献1 蔡玉枝,罗晓燕,苏文周. 高效液相色谱法测定猪组织中盐酸克伦特罗残留量J.中国卫生检验杂志,2002,4(12: 193-1942 戴华,袁智能,黄志强等.饲料中盐酸克伦特罗、沙丁胺醇高效液相色谱测定J.分析测试学报,2003(5:57-60 3 黄宏南,谢剑峰.盐酸克伦特罗(瘦肉精的检测方法进展J.中国卫生检验杂志 ,2003(5:27-284 何佳璐.高效液相色谱法测定猪肉中的盐酸克伦特罗J.海峡预防医学杂志,2006,2(12:47-485 韩森,马国霞,李卫芬.盐酸克伦特罗检测技术的研究进展J.畜牧与饲料科学,2006(2:33-356 侯仕农,闫强,马爱民.盐酸克伦特罗的药理作用、对食品安全的危害和检测技术J.内蒙古农业科技,2006(6:29-31 7 刘国艳,柴春彦.动物性产品中盐酸克伦特罗(瘦肉精检测方法研究进展J.动物科学禹动物医学,2002(4:32-34 8 刘平年.HPL