在体RNA干扰技术

1、在体在体RNA干干扰扰技技术术内内容容一般概念一般概念1RNAiRNAi的研究策略的研究策略2慢病毒体内作用方式慢病毒体内作用方式3慢病毒包装慢病毒包装- -上海吉凯上海吉凯3基因沉默基因沉默基因沉默基因沉默(gene silencing)是指由于各种原因，在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默发生在两种水平上基因沉默发生在两种水平上 a. 转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默(transcriptionalgene silencing，TGS): 由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的 b. 转录后基因沉默转录后基因沉默(posttranscriptiona

2、lgene silencing，PTGS): 即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(cosuppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。RNA干扰干扰RNA 干扰 (RNAi) 是有效抑制基因表达以研究各种细胞类型中蛋白质功能的最佳方法。 在哺乳动物细胞中进行基因抑制的传统 RNAi 方法，是使用由两条合成的、未经修饰的 21mer 寡核苷酸经过退火生成的 RNA 双链来形成短/小干扰 RNA (siRNA)。siRNA and miRNA 相同点/联系点 siRNA

3、miRNA 长度及特征 都约在22nt左右，端是磷酸基，3端是羟基 合成的底物 miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的 Dicer酶 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点 Argonaute家族蛋白 都需要Argonaute家族蛋白参与 RISC组分 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了on target和off target的问题 作用方式 都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用 进化关系 可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRN

4、A在进化过程中替代了siRNA 不同点/分歧点 siRNA miRNA 机制性质 往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况 是生物体自身的一套正常的调控机制 直接来源 长链dsRNA 发夹状pre-miRNA 分子结构 siRNA是双链RNA，3端有2个非配对碱基，通常为UU miRNA是单链RNA 对靶RNA特异性 较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变 相对较低，一个突变不影响miRNA的效应 作用方式 RNAi途径 miRNA途径 生物合成，成熟过程 由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中 pri-miRNA在核内由一种称为Dros

5、ha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中 siRNA and miRNA不同点/分歧点 siRNA miRNA Argonaute (AGO) 蛋白质 各有不同的AGO蛋白质 各有不同的AGO蛋白质 互补性一般要求完全互补 不完全互补，存在错配现象 RISCs的分子量不同siRISCs miRISCs/miRNP 各自的生物学功能不同 抵抗病毒的防御机制沉默那些过分表达的mRNA；保护基因组免受转座子的破坏对有机体

6、的生长发育有重要作用重要特性 高度特异性 高度的保守性、时序性和组织特异性 siRNA and miRNA不同点/分歧点 siRNA miRNA 作用机制 单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，siRNA也可以阻遏3UTR具有短片断互补的mRNA的翻译（off target）。 成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，

7、成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA。 加工过程 siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂 miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解。 对RNA的影响 降解目标mRNA；影响mRNA的稳定性 在RNA代谢的各个层面进行调控；与mRNA的稳定性无关 作用位置 siRNA可作用于mRNA的任何部位 miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区 生物学意义 siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑

8、制转座子活性和病毒感染 miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达 siRNA and miRNARNAi的研究策略的研究策略直接合成针对靶基因的针对靶基因的siRNA，通过转染使之进入细胞内，参与到RNAi途径，发挥使靶基因沉默的效应。这一方法受转染效率的影响较大受转染效率的影响较大，而且能顺利的进入RNAi途径的效率还有待验证。不过目前有不少基因的不少基因的siRNA已经有商业已经有商业产品产品，所以使用时买来就可以了，比较方便。而且直接合成的siRNA可以进行小分子多肽等配体标记小分子多肽等配体标记，可进行体内研究，注入体内后，通过配体的识别，被特定的细胞吸收，在特定的靶细胞内实

9、现RNAi研究。构建shRNA的质粒表达载体的质粒表达载体，转染细胞，在细胞内转录生成shRNA,利用细胞内的Dicer酶，生成相应的酶，生成相应的siRNA，发挥RNAi作用。 构建shRNA的病毒表达载体的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。转染方法转染方法转转染方法染方法化化学转学转染法染法物理物理转转染法染法病毒病毒转转染法染法DEAE-DEAE-葡萄糖法葡萄糖法磷酸磷酸钙钙法法人工脂人工脂质质体法体法显

10、显微注射法微注射法电电穿孔法穿孔法基因基因枪枪法法腺病毒腺病毒慢病毒慢病毒逆逆转录转录病毒病毒病毒表达系统比较病毒表达系统比较病毒表达系统病毒表达系统腺病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒逆转录病毒病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒RNA病毒是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞感染分裂和不分裂细胞感染分裂细胞,但在干细胞中表达效率低表达丰度高水平表达高水平表达高水平表达表达时间快（1-2 天）慢（2-4 天）快（1

11、-2 天）滴度滴度高达1012pfu/ml最高可达10910TU/ml最高可达10910TU/ml克隆容量可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性慢病毒体内作用途径慢病毒体内作用途径注射方式注射方式使用病毒量使用病毒量尾静脉 小鼠：1*107-2*107 TU/只，大鼠:5*107 TU/只 瘤体注射 瘤体多点注射，但是因为是实体瘤，所以比较难做，一般每个瘤体1*107-2*107 TU定点注射 一般1*107-2*107 TU尾静脉注射细胞做转移灶 小鼠

12、：5*105-1*106 个细胞/只 裸鼠成瘤 小鼠：细胞总量1*106-2*106 个细胞/只 病毒表达系统病毒表达系统腺病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统慢病毒表达系统病毒基因组病毒基因组双链DNA病毒RNA逆转录病毒自主复制自主复制不能不能是否整合是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因感染细胞类型感染细胞类型感染绝大多数细胞，包括分裂期、非分裂期细胞。感染绝大多数细胞，包括分裂期、非分裂期细胞。表达丰度表达丰度高水平表达中水平表达表达时间表达时间快（1-2 天）慢（2-4 天）滴度滴度滴度可达1012pfu/mL滴

13、度可达10E91010TU/mL克隆容量克隆容量可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性免疫原性高免疫原性低免疫原性RNAi病毒进入细胞往往引起细胞内干扰素反应，一般情况下不适合做RNAi实验适合，是RNAi实验的优选工具基因过表达基因过表达包装容量较大，可以满足较大基因的包装，是过表达基因的优选工具包装容量有限，过表达的基因过大时，病毒滴度受到影响过表达过表达microRNA 适合适合，是过表达microRNA实验的优选工具下调下调microRNA有报道但不成熟有报道但不成熟是否可以自行扩增是否可以自行扩增 可以需要特殊包装系统和包装环境上海吉凯上海吉凯上海吉凯上海吉凯Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:73Reproductive Biology and Endocrinology 2009, 7:73Journal o