石蜡包埋切片制作法

1、实用标准文案一、制备显微标本的切片法一石蜡包埋切片制作法这是最常用的切片法。以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。用切片机制取极薄的切片。为了让石蜡能浸入 组织内部，需将组织经过脱水等处理。过程大致如下：固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。凡供永久保存的标本都需经 固定处理。常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。还有由几种试剂配成的固定液， 例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含 水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。脱水：

2、是将组织细胞所含水分除去。通常用乙醇（ AlcohoI ,酒精），浓度递 升到100%。此过程还使组织块进一步硬化。透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代， 以便石蜡浸入。通常用二甲苯（xylene ）为透明剂。浸蜡：在温箱内进行。已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组 织，作为支持介质。包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包 埋。切片：用切片机。常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连 续切片。切片厚度随制片目的而调整。教学标本厚度多是56卩m。贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。

3、染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。二冷冻切片法冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。冷冻切片法需有 冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。恒冷切片机是高级冷冻切片设备。它 有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。 恒冷箱的作用类似冰箱，可在 一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温 度的干扰。切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的 影响，甚至可不经固定。所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，

4、因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。二、显示标本结构成分的染色法一苏木素伊红染色法（HE染色法）为最常用的染色法。该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对 任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用， 只是对不同包埋的切片法处理 略有不同。下面简介石蜡包埋切片的 HE染色法。1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。3、蒸馏水略洗。4、苏木素溶液染色约5 15分钟5、自来水洗去多余染料。6、入稀释的盐酸酒精溶液中分色，边分色边镜检，至核呈红紫色，

5、细胞质无 色为合适。7、分色后用自来水或加数滴氨水碱化，直至细胞核变成蓝色。这一步骤也可称 为“蓝化”。8、入蒸馏水洗去碱性水分。9、入70%酒精一 8%酒精各5分钟。10、入伊红染液染色30秒至数分钟。11、以95%酒精对伊红分色，至胞浆，结缔组织等呈桃红色。12、上行脱水：染色后的切片，因组织内含水而不透明，不能清晰地观察其微细结构。因此，须将组织内的水分经各级酒精一无水酒精逐步置换，最后进入不含水份的透明剂内。13、透明：入二甲苯透明剂，二次（各数分钟）。14、取出切片：将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。结果：细胞核蓝紫色，胞浆、胶原纤维、肌纤维为桃红色，嗜酸性颗粒为鲜红

6、色， 弹性纤维呈明亮桃红色。二组织化学和细胞化学染色法组织化学和细胞化学，是将物理和化学的技术运用到组织标本，用显微镜和化学 分析方法来研究组织和细胞内的化学成分， 并观察该化学成分在组织、细胞内的 定位、含量及其变化规律。这些化学成分借着化学反应所产生的不溶性着色物质 来显示。对于某些化学成分，例如：Fe+糖原、核酸等，可以用直接或间接的 化学反应产生着色沉淀而显示其部位和相对含量。对于酶类，显示它的活性，须 有该种酶的底物（被该种酶作用的物质），由酶对底物的分解，直接或间接地生成着色物质而被显示。凡是在光学显微镜下观察细胞原位显示的化学物质，称组 织化学，若用电镜观察细胞原位化学成分的着色

7、部位， 则称电镜细胞化学，下面 从原理方面简要介绍几种常用的组织化学染色技术：1、显示琥珀酸脱氢酶（SDH ）活性的硝基-BT法：（Succi nate dehydroge nase ）酶的定位及生物学意义：琥珀酸脱氢酶是线粒体标志酶，其存在于所有有氧呼吸的细胞，和线粒体内膜紧 密结合。该酶不需辅酶而自身有黄素蛋白（FP,Flavoprotein ）为辅基。在组化 反应中常用来反映三羧酸循环的情况。其催化过程如下：弱-单甲（紫红色）HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2 四唑（甲）J（有色）强-双甲（深紫蓝色）（琥珀酸）（黄素蛋白）HOOC-CH=CH=COOHFPH2 四唑（无色）（延胡

8、索酸）原理：上述的反应最后一步的原理是，硝基 -BT （Nitro-blue tetrozolyum，四唑氮蓝）系异环族化合物四唑盐，当它接受氢时，本身被还原为有色沉淀产物（甲）（Formazan ）。孵育液配制：A液（贮备液）0.2M磷酸缓冲液（PH7.6） 10ml等量混合0.2M 琥珀酸钠（SOl.succinate ） 10ml 备用B液：硝基四唑（Nitro-Br ）2mg2ml0.2M 磷酸缓冲液（PH7.6） 2ml取：A液2mlB液2ml孵育液聚乙烯吡烷酮（PVP）300mg方法： 新鲜恒冷箱冷冻切片，厚68卩m,平贴在盖玻片上。 滴染法：将有冷冻切片的盖玻片（标本面朝上）平放

9、于预热好的培养皿中（底部垫一湿滤纸），滴加孵育液至全部覆盖组织，于37 T温箱中孵育4560分钟 （肝，心肌组织15分钟即可）。 于生理盐水中冲洗二次（轻晃，以防脱片）。 10%福尔马林生理盐水固定10分钟。 15%酒精浸洗5分钟（换二次）。 甘油明胶封片。结果：酶活性强处呈蓝色颗粒（双甲沉淀），酶活性较低时形成紫红色单甲。在光镜下，该酶活性于肝小叶内分布呈明显分带现象，周边带强于中央带。在心 肌细胞纵切面，酶活性颗粒沿心肌细胞长轴整齐排列， 相邻心肌细胞的空白处为 闰盘。2、显示葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase )活性的铅法：(Glucosel-phosphate phosphohydr

10、olase )酶的定位及其生物学意义：该酶主要位于内质网，是内质网的标志酶。G-6-Pase参与糖代谢，能水解葡萄糖-6-磷酸而释放出葡萄糖和磷酸。原理：G-6-Pase将底物(葡萄糖-6-磷酸钾盐)水解产生磷酸离子，后者被孵 育液中的硝酸铅所捕获，最终反应物为颗粒状的硫化铅沉淀，其反应式如下：酶 Pb(NO3)2葡萄糖-6-磷酸钾+H2O葡萄糖+磷酸(NH4)2SPb2(PO4)2PbS J(无色)(棕色)(试剂配制及方法详见组织学技术专著)结果：酶活性部位呈棕色硫化铅颗粒沉淀。 在光镜下G-6-Pase活性颗粒较均 匀地分布于胞质中3、显示碱性磷酸酶(APL)的钙钻法(Alkaline p

11、hosphohydrolase )酶的定位及其生物学意义：ALP在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，参与磷酸根的跨膜转运过 程，并有磷酸转移的作用，故在细胞膜上运输较活跃，如毛细血管内皮细胞，肾 近曲小管刷状缘，肠上皮纹状缘等处，该酶的活性较高。原理：ALP将磷酸盐底物(如 伕甘油磷酸钠等)分解产生磷酸根离子，后者为孵育液中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，但该沉淀为非金属盐，需加入硝酸钻, 使其生成磷酸钻沉淀，因无色，再需通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钻沉淀而 被显示。在PH9.2 9.4环境中表现最大活性。反应式如下：ALPCa+禺甘油磷酸钠磷酸离子Ca2(PO4)2Co(NO3)2(NH

12、4)2SCO2 (PO4) 2CoS J(无色)(棕黑色)结果：酶活性部位为棕黑色 CoS沉淀。4、显示核酸的甲绿一派喏宁(Methyl gree n-pyro nln)染色：原理：甲绿和派喏宁都是碱性染料，对两种核酸(DNA和RNA)能分别染色, 其机制可能在于两种核酸分子都是多聚体，但聚合程度有所不同。甲绿具有两个带电荷的氨基，而派喏宁只有一个。因此在混合的染液中，二者竞争的结果是甲 绿易与聚合程度较高的DNA结合呈现蓝绿色，而派喏宁则与聚合程度较低的 RNA结合呈现红色。(试剂制备及方法详见组织学技术专著)结果：核内DNA呈蓝绿色，核仁及胞质内 RNA呈桃红色。5、显示糖原的过碘酸雪夫氏（PAS）反应：原理：糖原是一种动物多糖，无色，富含于肝细胞和肌细胞胞质中。PAS反应（Periodic acid schiff Reaction ）能在糖原所在部位生成紫红色物质，从而