一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立

1、一种高效扩增人T细胞受体链可变区基因的方法建立         11-01-28 13:42:00     编辑：studa20          作者：叶海燕, 王琳, 范振平 钟彦伟 苏何玲 刘永明, 徐东平【摘要】  目的: 建立一种高效扩增人T细胞受体（TCR）链可变区（V）基因的方法。方法: 根据TCR V26个亚家族基因序列特点设计扩增V基因的上游内引物34条、 上

2、游外引物37条, 并将内、 外上游引物各分为8个简并组。在恒定区（C区）设计下游内、 外和测序引物各1条以及扩增C基因的上游引物1条。提取细胞RNA, 用PolyA介导反转录后, 采用巢式PCR扩增正常人CD8 T细胞TCR V26个亚家族基因, 并用Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照。用Teasy载体克隆RTPCR 产物, 对克隆基因进行测序。结果: 从正常人的CD8 T细胞中扩增到所有TCR V亚家族基因, 克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCR V8基因, 经测序验证与文献报道一致, 且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论: 建立的巢式RTPCR方法

3、可以高效、 广谱地扩增人TCR V基因, 为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。 【关键词】  CD8 T细胞; T细胞受体（TCR）; 反转录PCR; 基因克隆    Abstract  AIM:   To develop an effective assay for amplifying human Tcell receptor (TCR) variable region of chain (V)encoding genes.  METHODS:   B

4、ased on the property of the 26 subfamilies of human TCR Vencoding gene sequence,  34 sets of outer and 37 sets of inner sense primers were divided into 8 degenerate primer groups,  and a set of outer and inner antisense primers located in conserved region chain (C) was designed for the amp

5、lification of the TCR Vencoding genes. In addition,  a sequencing primer and a sense primer for amplifying Cencoding genes were designed. CD8 Tcell RNA was extracted and subjected to reverse transcription mediated by poly A,  followed by a nested polymerase chain reaction (PCR) to amplify

6、the 26 subfamilies of human TCR Vencoding genes. Jurkat T lymphoma cells were used as control. Teasy vector was employed to detect DNA sequencing of the cloned target genes.  RESULTS:   All the subfamilies of the Vencoding genes were obtained from CD8 T cells of a healthy donor, 

7、 except the subfamily of V8 , was obtained from Jurkat cells. The results were confirmed by DNA sequencing of the cloned genes.  CONCLUSION:   The nested RTPCR assay can effectively amplify human TCR Vencoding genes with broad spectrum,  which is helpful for the cloning and funct

8、ional study of the TCR expressed by antigenspecific cytotoxic T lymphocytes.    KeywordsCD8 T cell;  Tcell receptor (TCR);  RTPCR;  gene cloningT细胞受体（Tcell receptor,  TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子, 可分为TCR/和TCR/两种类型, 外周血T细胞主要为TCR/的T细胞, 是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。TCR基因由可变区（V）

9、、 多变区(D)、 结合区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成。在T细胞发育过程中V区、 D区和J 区进行重排而形成具有功能的TCR编码基因, 重排的过程中VD和DJ 之间可有不同数量的核苷酸随机插入或删减的现象, 这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性, 以识别各种不同的抗原1。因此, 分析TCR V亚家族的表达和利用情况, 对阐明肿瘤、 自身免疫性疾病以及病毒感染等疾病的致病机制十分重要2-4。然而由于TCR V的多样性, 采用已往报道用的RTPCR方法在T细胞数量很少以及TCR表达很微量的情况下扩增TCR基因灵敏度不高或代表性不够。本研究通过优化引物设计和应用巢式RTPCR使

10、TCR V的扩增具有很高的灵敏度和广泛的代表性。PCR产物进一步做DNA克隆, 挑取单克隆菌落测序, 了解TCR V链的表达和分布情况, 为进一步研究病毒感染时特异性T细胞TCR的偏性取用（bias usage）和克隆性增殖的情况提供了方法学基础。    1  材料和方法    1.1   材料  用于分选CD8 T细胞的外周血单个核细胞（PBMC）来自1例男性健康成年人, Jurkat 淋巴瘤细胞为本室保存, MACS（Magnetic activated cell sorter）磁珠分选CD

11、8 T细胞的试剂与分离柱和分离器购自德国Miltenyi Biotec公司, 荧光标记的抗CD3和抗CD8抗体购自美国BDPharmingen公司, 提取细胞RNA的RNessy mini盒、 PCR产物回收和凝胶电泳产物回收试剂盒均购自德国Qiagen公司, 反转录试剂盒和pGEM Teasy 载体均购自美国Promega公司。    1.2  方法    1.2.1  PBMC分离和CD8 T细胞分选  按照常规方法分离PBMC, CD8 T细胞的MACS磁珠分选操作方法按说明书进行。分选后的CD8

12、T细胞用荧光标记的抗CD3和抗CD8抗体染色、 流式细胞术（FCM）检测CD8 T细胞的纯度和数量, 用RPMI1640液调整细胞密度至 2×109/L备用。    1.2.2  引物  根据文献资料5,  6和从GenBank下载的257条人TCR V基因序列进行分析, 根据V各个亚家族的基因序列特点, 在相对保守的信号肽区设计出相应的25个亚家族特异性上游引物(V26亚家族基因为假基因, 故不设计实验), 因为有些TCR V亚家族内部还分为几个不同的分家族, 故共设计了上游外引物34条和上游内引物37条; 在C区设计下游

13、外引物down1、 下游内引物down2、 测序引物down3各1条, 以及扩增C基因的上游引物C1（表1）。引物由上海生工公司合成。表1  扩增TCR V和C编码基因的引物设计    1.2.3  RNA提取和巢式RTPCR反应  CD8 T细胞或Jurkat细胞RNA的提取按照文献7的方法进行。应用(oligo)dT引物反转录合成cDNA第1链, 反转录反应条件为40 1 h。以cDNA为第1轮PCR反应模板, 将上游外引物分为8组简并引物分别与down1进行8个PCR反应, PCR扩增总体积为25 L/管, 反应条件为94 5

14、min; 94 30 s,  59 30 s（每个循环递减1）, 55 30 s, 72 1 min, 30个循环;  72  5 min; 68 5 min。第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板, 将对应的8组简并上游内引物分别与down2加入各反应管中, 反应体积为50 L/管, 反应条件为94 3 min; 94 30 s, 60 1 min, 72 1 min, 40个循环; 72 5 min; 68 5 min; Jurkat细胞RNA模板扩增基因片段长度为578 bp。一些实验中, 第2轮PCR反应使用单一上游引物分管反应, 以确定各亚家族引物的扩

15、增效率。同时扩增actin和TCR C编码基因做为质控对照。RTPCR反应扩增TCR链编码基因的步骤示意见图1。    1.2.4  DNA克隆  PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶（溴乙锭染色）中进行电泳分析, 挑取V14亚家族基因的PCR产物做DNA克隆, 切取目的基因片段, 回收PCR产物, 与pGEM Teasy 载体连接。将重组质粒转入细菌JM109, 氨苄青霉素和Xgal 蓝白斑法筛选阳性菌落, 挑取15个单克隆白色菌落于10 L H2O中 94加热10 min以裂解菌体后, 按第2轮PCR体系进行PCR反应, PCR经电泳鉴定后提

16、取重组质粒进行测序, 测序引物为down3。    1.2.5  序列对比  根据文献报道的标准序列号, 应用Vector NTI 软件的AlignX组件以及Virusblast软件, 将本实验所测的TCRV编码基因序列与已知各种TCR V编码基因参考序列进行比对。    2  结果    2.1  RTPCR扩增TCR链编码基因  经反转录和用8组简并上游引物和下游引物介导二轮PCR扩增后, Jurkat细胞样本只有在含V8亚家族引物的4B组扩增到了目的条带, 测序结果与文献报导一致, 为V8; CD8 T细胞在分选后纯度为95.9%, 样本在8组中均扩增出目的条带（图2B）; 用各种单一引物进行第2轮PCR反应时所有亚家族引物均可获得扩增条带, 图2B显示了以第1组上游简并引物介导的第1轮PCR产物为模板, 第2轮中采用同组5种单一上游引物扩增的结果。actin和C编码基因经一轮PCR扩增即可获得目的条带（图片未显示）。图2A显示用含V8亚家