水稻AOX1基因家族成员逆境下的表达分析及功能鉴定

1、水稻 AOX1基因家族成员逆境下的表达分析及功能鉴定高等植物线粒体电子传递链主要有两条途径, 一条是对氰化物敏感的细胞色素途径 , 另一条是抗氰呼吸途径 ( 或称交替途径 ), 对氰化物不敏感 , 是由线粒体内膜上的末端氧化酶AOX(交替氧化酶 ) 所催化的。电子从细胞色素途径的泛醌处分支直接将电子传递给AOX,由 AOX氧化生成水 , 不生成 ATP,能量以热的形式释放。AOX属于双核铁羧基蛋白质家族, 由小的核基因所编码。 AOX的表达受到多种生物和非生物胁迫所诱导。关于 AOX的生物学功能和抗氰呼吸途径一直是植物生理学领域中研究的热门课题。目前单子叶植物中AOX的研究较少 , 已有的研究

2、多集中于冷、旱等单一逆境胁迫下 AOX整体水平的研究 , 对各个成员的研究较少 , 信号调控途径也不清楚。本研究首先利用 OsAOX1基因的特异性探针 , 研究了在逆境 ( 冷、热、盐、旱)和氧化药物处理下OsAOX1基因家族的表达模式；并从水稻中克隆了OsAOX1 ,OsAOX1b基因对其序列进行了测序比对和进化分析。同时还构建了OsAOXl ,OsAOX1b基因的植物超表达载体 , 利用农杆菌介导转化水稻( 日本晴 ), 获得转基因植株 , 对 T2 代纯合转基因植株进行了抗逆生物学的功能分析, 和逆境 ( 冷和早 )条件下转基因超表达植株的生理指标( 电导率和丙二醛含量 ) 测定 , 显

3、示结果如下：(1) 根据生物信息学资料 , 设计 OsAOXl, OsAOX1b,OsAOX1c的特异性引物 , 对其在逆境下的表达模式进行了分析。结果表明： OsAOX1 和 OsAOX1b受各种逆境胁迫的诱导 ,OsAOX1c基本不受诱导。在盐、旱、冷逆境胁迫下 OsAOX1, OsAOXb 诱导倍数随时间的延长而逐渐增长 ,OsAOX1在盐、旱、冷逆境胁迫24h 时出现最高诱导倍数 , 依次为 30.7倍、12.3 倍、17.5 倍；OsAOX1b最高诱导倍数依次为36.6 倍、15.2 倍、7.1 倍。OsAOX1在热胁迫下表达水平变化趋势与盐、旱、冷逆境下变化趋势相同,但 24h 最

4、高诱导倍数为对照的 8.9 倍。OsAOX1b受热胁迫表达水平变化并不像盐、旱、冷诱导倍数随时间延长呈现明显增长 , 其受高温诱导最高诱导倍数为 10.6倍出现在受胁迫1h。此外 OsAOX1, OsAOX1b在氧化药物 H202和 MV(甲基紫精 ) 处理下的表达量变化分析显示：二者均受这西种氧化药物的诱导。OsAOX1和 OsAOX1b受 H202诱导表达变化均在5 倍以下；而在 MV胁迫下表达量变化较H202明显增强 ,OsAOX1 受诱导 38.8 倍,OsAOX1b受诱导 117.2 倍。(2) 利用反转录 PCR (RT-PCR)从水稻中克隆得到了两个基因 OsAOX1, OsAO

5、X1b. OsAOX1 (LOC-Os04g51150) 基因序列全长为 999bp, 含有四个外显子和三个内含子 , 该基因预测编码 333 个氨基酸 , 分子量为 37136.5D, 等电点为8.2369 。 OsAOX1b(LOC-Os04g51160)基因序列全长为1008bp, 有三个外显子和两个内含子 , 该基因预测编码336 个氨基酸 , 分子量为 37250.5D, 等电点为 8.0404 。(3) 构建了相应的超表达载体 ( 记为 OE-OsAOX1和 OE-OsAOX1b),通过农杆菌介导进行水稻遗传转化 , 对得到的转基因植株 T0 代幼苗进行 PCR鉴定后移栽种植。对

6、To 代转基因植株所结的种子经潮霉素萌发鉴定, 挑选分离比符合 3：1 的株系。对这些株系的 T1 代幼苗进行 PCR鉴定和 western blot分析 , 表明在 T1 代转基因水稻中 OsAOX1, OsAOX1b 已成功表达。 (4) 将 T1 代中选出的株系扩繁至T2 代, 经 PCR鉴定、表达量鉴定和 western blot分析验证基因稳定表达后, 对 T2代转基因植株进行了功能分析。低温胁迫下 , 超表达转基因植株较对照植株明显提高了抗冷性；且 OsAOX1和 OsAOXlb超表达植株和对照植株相比 , 无论是地上部分还是地下部分都表现出更强的耐冷性。 冷胁迫下 OE-OsAO

7、X1转基因株系 linel 的根长和茎长分别是同时期对照植株根长和茎长的 3.8 倍和 3.2 倍； OE-OsAOX1 转基因株系 line2 的根长和茎长分别是对照植株根长和茎长的2.8 倍和2.5倍； OE-OsAOX1b转基因株系line3的根长和茎长分别是对照植株根长和茎长的5.2 倍和5.8倍；OE-OsAOXlb转基因株系 line4的根长和茎长分别是对照植株根长和茎长的4.8倍和 6.0 倍。(5) 在功能验证的基础上 , 对 T2 代纯合植株进行了逆境下电导率和丙二醛含量 (MDA)生理指标的测定。 结果表明：冷胁迫下 OE-OsAOX1的转基因植株 line1和line2的电导率比同时期对照植株依次降低1.1 倍和1.22倍,OE-OsAOX1b的转基因植株line3和 line4则依次降低了1.45 倍和1.57倍。冷胁迫下两种超表达植株的MDA含量分析指出：OE-OsAOX1的转基因 linel和 line2 株系 MDA含量比对照植株依次降低了 1.1 倍和 1.32 倍；OE-OsAOX1b的转基因