小鼠侵袭性肺曲霉病发病过程中TLRs_NF_B信号通路的激活_图文

1、¹本文为国家自然科学基金项目(30560147和30760236º南昌大学医学院微生物学教研室,南昌330006作者简介:李 祥(1986年-,女,在读硕士,E -mail:,同时工作于江西省景德镇妇幼保健院药剂科,景德镇333000;通讯作者及指导教师:谢小梅(1964年-,女,博士,教授,主要从事微生物与免疫学研究;刘金辉(1965年-,男,硕士,副教授,主要从事微生物与免疫学研究。doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2010.10.004小鼠侵袭性肺曲霉病发病过程中TLRs/NF -J B 信号通路的激活¹

2、李 祥 罗闳丹 石 青º 谢小梅 刘金辉º(江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室,南昌330004中国图书分类号 R341 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(201010-0881-04摘 要 目的:研究小鼠侵袭性肺曲霉病(IPA发生过程中TLRs/NF -J B 信号通路的激活,探讨IPA 的发病机理。方法:小鼠随机分为正常组(N、正常接菌组(N+Af和IPA 模型组(IPA ,经鼻吸入烟曲霉(Af孢子后在不同时相点处死小鼠,无菌取肺组织行病理切片、Af 菌落计数,RT -PCR 法检测TLR2和TLR4mRNA 、蛋白印迹法检测NF -J B p65、I

3、L -1B 的表达。结果:(1鼻吸入Af 后72小时时,IPA 组肺组织出现严重炎症反应,并有大量的菌丝生成,同时各时相点的菌负荷均高于N +Af 组;(2与N+Af 组比较,IPA 组TLR2mRNA 后期异常高表达,TLR4mRNA 持续低表达,NF -J B p65早期骤然升高后又持续下降,IL -1B 一直呈低表达状态。结论:TLRs 的异常激活导致宿主下游信号的低反应性,宿主不能清除Af 促使了IPA 的发生发展。关键词 TLR/NF -J B;侵袭性肺曲霉病;Af;天然免疫;模式识别受体The activation of TLRs/NF -J B signal pathways i

4、n the invasive pu lmonary as -pergillosis of miceLI Xiang ,LUO Hong -Dan,SHI Qing ,XIE Xiao -Mei,LIUJin -Hui.Key Laboratory o f Mo dern Preparations o f Traditional Chinese Medicine,Ministry o f Education,Jiangxi University o f Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,ChinaAbstract Objective:To

5、study the activation of TLRs/NF -J B si gnal pathway in Invasive Pulmonary Aspergillosis.Methods:The mice were randomly selected into three groups:the normal mice(N,the normal mice with infection(N+Afand IPA mice(IPA.The mice were ad -mini strated wi th Aspergillus f umigatus (Afvia intranasal and s

6、acrificed at different ti me.The lung tissue of mice were extracted under sterile condition,and then studied by pathological section,counting the lung burden and detecting the expression of the TLR2、TLR4mRNA by RT -PCR,NF -J B and IL -1B with the Western blot.Results:72hs later after infection,IPA m

7、ice were ser i ous inflammatory reaction and hypha ap -peared,also lung burdern was higher than in N mice.Compared to the N+Af mice,TLR2mRNA of IPA mice were high expression abnormally at late time with,persistent low expression TLR4mRNA,and NF -J B p65increased sharply early and then decreased pers

8、istently,IL -1B was in low expression.C onclusion:The abnormally activation of TLRs/NF -J B induces low acti on of the downstream,so hosts can .t clear the As -pergillus fumigatus which results in the development of IPA.Key w ords TLR/NF -J B;Invasive pulmonary aspergillosis;Aspergillus fu migatus;I

9、nnate immune;Pattern recogni tion receptors侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis,IP A是临床常见的真菌感染性疾病,为烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,Af侵入免疫受损宿主所导致的感染。近年来,随着恶性肿瘤、器官移植、HIV 等免疫受损患者的增多,IPA 发病率逐年上升,致死率高达60%95%,迄今发病机理仍不清楚1。综合现有研究发现:IPA 的发生发展是宿主的免疫机制与Af 毒力因素相互作用的结果。宿主抵抗Af 感染的防御能力包括天然免疫应答和适应性免疫应答,其中天然免疫系统中的模式识

10、别受体(Pattern recog -nition receptors,PRRsTLRs 已成为研究热点。大量研究证实了TLRs 在细菌、真菌等感染中发挥重要作用,它们与病原体的相应配体结合后激活效应分子,通过活化的效应分子激活转录因子NF -J B,从而产生一系列的免疫应答。国外多采用基因敲除的方法研究TLRs 信号通路在IP A 中的作用,但是结果并不完全一致。为了整体、系统的模拟人类IPA 的发生,本研究针对基因完整型免疫抑制小鼠感染Af 过程中TLRs/NF -J B 信号通路的激活进行了观察。通过建立小鼠IPA 模型,研究小鼠感染过程中肺组织TLR2、TLR4、NF -J B 、IL

11、 -1B 的表达变化,探讨TLRs/NF -J B 信号通路在IPA 发生中的作用,为临床诊断和治疗IPA 提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料 B ALB/c 小鼠,68周龄,雄性,购自上海西普尔-必凯实验动物中心,合格证号:SCXK(沪2003-0002。Af(临床分离株,分离号3910:购自中国医学真菌菌种保藏管理中心。环磷酰胺(No.06060521,江苏恒瑞医药股份有限公司。Trizol 试剂,Invitrogen 公司;RNA 提取试剂盒,TaKa Ra 公司;兔抗NF -J B p65、兔抗IL -1B 和山羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗均为Santa Cruz 公司。引物由上

12、海生工生物工程有限公司合成。1.2 方法1.2.1 小鼠随机分3组,每组25只:¹正常组(正常健康小鼠,N;º正常接菌组(健康小鼠接种Af,N+Af;»IPA 模型组(小鼠给予免疫抑制并接种Af,IP A。1.2.2 IPA 模型的建立 参照文献2进行。分别于接种后24、48、72、120、144小时各时相点处死小鼠(每个时相点5只,取肺组织行石蜡包埋,切片, HE图1 肺组织HE 染色图(200Fig.1 Results of HE staining of the lungs (200Note:A.N;B.N+Af;C.IPA.染色镜检。1.2.3 肺组织菌落计

13、数 取肺组织制成10%匀浆,稀释100倍后取0.1ml 接种于蔡氏培养基,5天后计数菌落。1.2.4 RT -PCR 法检测TLR2和TLR4mRNA 表达 引物序列及反应条件见表1。1.2.5 蛋白印迹法检测NF -J B 和IL -1B 表达 提取肺组织的核蛋白和总蛋白,SDS -PAGE 电泳后转膜,与一抗(1B 250和二抗(1B 800037e 孵育1小时,EC L 法显色后X 线胶片曝光。1.3 统计学方法 所有实验数据以x ?s 表示,采用SPSS13.0统计软件处理,行t 检验法分析,以P <0.05为有统计学意义。2 结果2.1 病理变化 接种72小时后,N+Af 组肺

14、泡间隔增宽,有炎症细胞浸润、出血等炎症反应;IPA 组出现肺脓肿,严重出血和充血,气管上皮细胞脱落,并有大量的菌丝生成(见图1 。图2 RT -PCR 产物Fig.2 RT -PCR productsNote:A,C(N+Af:1.Marker;2.24h;3.48h;4.72h;5.120h;6.144h;B,D(IPA:1.M arker;2.24h;3.48h;4.72h;5.120h;6.144h.表1 引物序列及PC R 反应条件Tab.1 Primer sequences and PC R reactive conditionsNameSequenceAnnealing tempe

15、rature (e PCR product (bpTLR2Pri merups tream:5c -ACCTCCCTTGACATCAGC -3c 59902Downs tream:5c -TCG TACTTGCACCACTCG -3c TLR4Pri merups tream:5c -ATCTG GTGGCTGTGGAG AC -3c 59288Downs tream:5c -TTCCCTG AAAGGCTTGG TC -3c B -tublinPri merups tream:5c -AAGGG TCACTACACCGAG -3c 59506Downs tream:5c -GCG AATCC

16、TGGCATGAAG AAGT -3c表2 肺组织菌落计数(x ?s ,n =5,CFU/mlTab.2 Lungs burdern of Af (x ?s ,n =5,CF U/mlGroup Ti me24h 48h 72h 120h 144h Normal mice wi th infection1605?298.81738?254.0210?43.278?11.336?5.2IPA mice25800?5533128100?6129115750?3096117500?254319500?10111Note:1P <0.05,vs N+Af. 图3 TLR2mRNA 表达Fig.3

17、 The expression of TLR2Note:*.P <0.05,vs N.图4 TLR4mRNA 表达Fig.4 The expression of TLR4Note:*.P <0.05,vs N;v .P <0.05,vs N+Af2.2 菌负荷 正常组Af 培养呈阴性;IPA 组与N+Af 组均可见菌落形成,且各时相点的菌落数IPA 组均多于N+Af 组(P <0.05,见表2。2.3 TLR2和TLR4mRNA 表达 TLR2:正常组呈低表达且无显著性差异;与正常组比较:N+Af 组在72小时前高表达,此后降低,至120小时后恢复到正常,而IPA 组呈

18、持续高表达(P <0.05,见图24。TLR4:正常组呈低表达且无显著性差异;与正常组比较,N+Af 组、IPA 组均呈高表达,但IPA 组的表达低于N+Af 组(P <0.05。2.4 NF -J B p65和I L -1B 表达 NF -J B p65:正常组无显著性差异。N+Af 组24小时后逐渐缓慢升高,72小时后开始缓慢下降至正常;IP A 组24小时后陡然升高,48小时达峰值后迅速且持续下降并低于正常(P <0105,见图57。 I L -1B :正常组无显著性差异。N+Af 组呈高表达,图5 蛋白印迹产物Fig.5 Wes tern blot bandsN ot

19、e:A,C(N+A f:1.24h;2.48h;3.72h;4.120h;5.144h;B,D(IP A:1.24h;2.48h;3.72h;4.120h;5.144h.图6 NF -J B p65表达Fig.6 The expression of NF -J B p65N ote:*P <0105,vs N+Af a t 24h;$.P <0105,vs IP A at 24h图7 IL -1B 表达Fig.7 The expression of IL -1BN ote:*.P <0.05,vs N+Af a t 24h;v .P <0.05,vs IP A at 2

20、4h.且24小时后较快上升,到48小时达峰值(P <0.05后缓慢降低;与N+Af 组比较,IPA 组呈低表达且直至48小时后才逐渐小幅升高,至120小时(P <0.05后表达下降。3 讨论Af 是一种气传真菌,可以通过无性生殖产生大量分生孢子,其菌丝是导致IPA 发生的主要形态。正常宿主吸入的烟曲霉孢子经气管粘膜的纤毛细胞可以清除,而免疫抑制宿主吸入分生孢子后,孢子可以定植在肺部并萌发出菌丝。糖皮质激素类诱导的免疫抑制病人会出现过量的多形核白细胞聚集抑制菌丝生成,导致严重的炎症反应;而化疗药物治疗的中性粒细胞减少症病人则无法募集多形核白细胞,导致菌丝过量生长,进一步发展可经血液播

21、散导致全身多器官受累3。TLRs 属于I 类跨膜受体,广泛分布于单核巨噬细胞系统、内皮细胞、树突细胞等,其配体包括内毒素(LPS、肽聚糖(PGN等。TLRs通过识别入侵微生物的病原体相关分子模式,激活天然免疫应答并诱导适应性免疫反应。TLRs的激活引起一系列下游分子的活化,导致NF-J B信号通路的激活,最终导致多种炎症因子TNF-A、IL-1B等的瀑链式释放而产生生物学效应4,5。在Af感染的体内实验中,Belloc-chio等6用环磷酰胺免疫抑制的TLR4-/-和TLR2-/-小鼠实验发现仅TLR4参与了体内抗感染的防御,但是Balloy等7利用长春碱造成中性粒细胞减少TLR2-/-小鼠的

22、实验证明了TLR2在抗Af感染中发挥作用。同样的,研究者的体外实验也得到了一些不一致甚至相反的结果。本实验采用环磷酰胺免疫抑制小鼠,并鼻吸入Af孢子建立IPA模型,72小时时的病理切片显示小鼠肺组织严重出血和充血,气管上皮细胞脱落并伴有大量菌丝生成,类似临床IPA的病理变化。菌负荷结果显示,IPA模型组小鼠感染24小时后菌负荷严重,至144小时时仍不能有效地清除,说明免疫受损小鼠感染Af后不能有效启动免疫系统杀灭孢子并抑制菌丝的生成,从而导致IPA发生发展。TLRs/NF-J B信号通路是机体炎症和免疫反应调节的重要环节,与正常小鼠感染AfTLR2、TLR4 mRNA的动态变化比较,本实验发现

23、IPA模型组小鼠TLR2mRNA的后期异常高表达以及TLR4mRNA 的持续低表达(P<0.05,表明在IPA发生过程中TLR2后期被异常激活,而TLR4则长时间抑制。宿主正常的TLRs信号传导与一些负调节因子相关,其中NF-J B和IL-1B是TLRs介导的炎症反应的主要下游信号,且NF-J B的产生可以负反馈调节TLRs的激活8。进一步的研究发现,正常接菌组小鼠NF-J B p6524小时后变化缓慢而平稳,而IPA模型组小鼠在24小时后陡然升高,48小时达峰值后迅速且持续下降,结合本实验中TLRs的动态变化,推测可能是TLRs的异常激活导致了NF-J B的激活紊乱,NF-J B的负反

24、馈调节作用失调。同时,IL-1B作为主要的促炎症因子在正常接菌组感染前期有明显的升高,而IPA模型组中呈持续低表达,仅72小时后缓慢小幅升高至120小时后表达下降,IL-1B的这种长时间低表达可能导致宿主不能有效清除Af。TLRs识别微生物病原体是激活天然免疫和适应性免疫的关键,多重的分子调控机制保证了复杂适当的TLRs信号激活,然而当TLRs激活发生紊乱时其下游信号也会受到影响,延迟、反复的TLRs激活会导致感染性疾病的发生9。本研究结果提示IPA小鼠TLR2或TLR4的异常激活,NF-J B的负反馈调节作用失调,致下游信号NF-J Bp65和IL-1B的延迟或/和低表达,表明TLRs/NF

25、-J B信号通路传导出现了异常,TLRs的异常激活导致宿主下游信号的低反应性,最终促使了IPA的发生发展。4参考文献1Balloy V,Chi gnard M.The innate immune response to Aspergillus fumiga-tusJ.Microbes Infec t,2009;11(12:919-927.2罗闳丹,施,谢小梅et al.侵袭性肺曲霉病实验小鼠模型的建立J.江苏医药,2008;34(1:66-68.3Dagenais T R,Keller N P.Pathogenesi s of Aspe rgillus fumigatus in Inva-sive Aspergillos isJ.Cli n M icrobiol Rev,2009;22(3:447-465.4Raeburn C D,Calki ns C M,Zi mmerman M A e t al.Tol-l li ke receptors and s urgical di seas eJ.Surgery,2002;131(5:477-483.5Kumar A,Zhan