抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验_RFFIT_的建

1、20世纪60年代初,WHO 开始推荐使用小鼠脑内中和法(Mouse neutralization test ,MNT 测定抗狂犬病病毒中和抗体。但自80年代中期开始,发现MNT 法实验时间较长(至少需14d ,受动物质量、攻击病毒的滴度、实验人员的操作技术和经验等多种因素的影响,重复性、一致性和灵敏性均较差,而且需要使用大量动物,不符合国际上动物实验3R 的原则1。为此,WHO 在许多国家实验的基础上,推荐快速、精确和重复性好的体外检测抗狂犬病病毒中和抗体的方法,即快速荧光灶抑制试验(Rapid flu -orescence focus inhibition test ,RFFIT 和荧光抗体

2、病毒中和试验(Fluorescent antibody virus neutralizationtest ,FAVNT 2,3。本文对RFFIT 法与MNT 法的相关性进行了分析,现将结果报道如下。作者单位:1中国药品生物制品检定所病毒一室(北京100050;2Institut Pasteur,Paris,France.通讯作者:董关木,E -mail :gmdong中国图书分类号R392Q33文献标识码A 文章编号1004-5503(200911-1145-04【实验技术】抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验(RFFIT 的建立及应用吴小红1李加1唐建蓉1Herv éBour

3、hy 2刘景华1曲效民1曹守春1董关木1【摘要】目的建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFIT ,验证其与小鼠脑内中和法(MNT 的相关性,并用于马抗狂犬病病毒血清(ERIG 和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG 及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定。方法待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%95%细胞量的攻击病毒混合后,37体外中和1h ,接种BSR 细胞,培养24h 后荧光染色,荧光显微镜下读取结果。用建立的RFFIT 法与MNT 法同时标定狂犬病免疫球蛋白国家标准品,并检测ERIG 和HRIG 以及疫苗免疫后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,以比

4、较两种方法的精密度和相关性。结果采用MNT 法和RFFIT 法检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT 分别为21.4和23.8IU /ml ,两种方法的变异系数分别为62.3%和13.3%;两个实验室用RFFIT 法测定我国国家标准品的结果分别为21.71和23.81IU /ml 。两种方法测定ERIG 和HRIG 及疫苗免疫后血清中和抗体效价的结果差异无统计学意义,相关系数为0.976,两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。结论RFFIT 法可替代MNT 法检测抗狂犬病病毒中和抗体效价。【关键词】狂犬病;中和抗体;快速荧光灶抑制试验;小鼠脑内中和法Development and Ap

5、plication of Rapid Fluorescence Focus Inhibition Test(RFFIT for Determination of Potency of Neutralizing Antibody against RabiesWU Xiao -hong ,LI Jia,TANG Jian -rong,et al (National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biologi -cal Products ,Beijing 100050,China 【Abstract 】Objective To de

6、velop a rapid fluorescence focus inhibition test (RFFIT for determination of potency of neutrali-zing antibody against rabies and investigate its correlation to mouse neutralization test (MNTas well as its application to determination of serum neutralizing antibody potencies in equine rabies immunog

7、lobulin (ERIG ,human rabies immunoglobulin (HRIG and human sera immunized with rabies vaccine.MethodsThe sera or immunoglobulin to be tested were diluted 3-fold serially on a 96-wellmicroplate,mixed with a constant dosage of challenge virus causing infection of 80%95%of cells and incubated at 37for

8、1h for in vitro neutralization,then inoculated with BSR cells,incubated for 24h and subjected to fluorescence staining.The result was ob -served by fluorescent microscopy.National standards for rabies immunoglobulin were simultaneously calibrated by the developed RF -FIT and MNT,and the neutralizing

9、 antibody potencies in ERIG,HRIG and human sera immunized with rabies vaccine were deter -mined by the two methods separately,to evaluate their precisions and correlation.Results The GMTs of national standards for rabies immunoglobulin determined by MNT and developed RFFIT were 21.4and 23.8IU /ml,wi

10、th CV values of 62.3%and 13.3%,while those by RFFIT by two laboratories were 21.71and 23.81IU /ml,respectively.The determination results of neutralizing anti -body potencies in ERIG,HRIG and human sera immunized with rabies vaccine by the two methods showed no significant difference,with a correlati

11、on coefficient of 0.976,indicating a good positive correlation.Conclusion The developed RFFIT may be used for de -termination of potency of neutralizing antibody against rabies instead of MNT.【Key words 】Rabies;Neutralizing antibody;Rapid fluorescence focus inhibition test (RFFIT ;Mouse neutralizati

12、on test (MNT 1.材料与方法1.1病毒及细胞BSR细胞和狂犬病病毒CVS IP10均来源于巴斯德研究所。BSR细胞用含10%小牛血清的DMEM 培养基培养,按13比例传代扩增;狂犬病病毒CVS IP10由中国药品生物制品检定所病毒一室在BSR细胞中适应传代和扩增,并建立三级种子批,取工作种子CVS-9用于RFFIT检测。1.2主要试剂国家第4批抗狂犬病病毒抗体标准品由中国药品生物制品检定所以WHO第3批抗狂犬病血清标准品标定效价;FITC标记的小鼠抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体购自Chemicom公司(批号:0605030729。1.3待检血清及人抗狂犬病免疫球蛋白接种人用狂犬病纯化

13、疫苗(Chiron Vaccines GmbH Co.,Germany生产前后的人血清由上海诺华贸易有限公司提供;马抗狂犬病病毒血清(ERIG及人狂犬病免疫球蛋白(HRIG为国内不同企业注册检验送检产品。1.4快速荧光灶抑制试验参照文献4,5方法进行。将待检血清或免疫球蛋白、标准品及实验内部参考品分别作3倍系列稀释,加入96孔细胞培养板中;再加入50l经预先滴定的病毒液(80%95%的细胞可呈现荧光染色的病灶,同时设病毒回滴对照及细胞对照,37中和1h;每孔加入50l BSR细胞(1×106个/ml, 37,5%CO2孵箱培养24h;吸弃上清液,细胞用PBS洗涤1次,加入4预冷的丙酮

14、,4固定30min;弃去丙酮,每孔加入50l FITC标记的小鼠抗狂犬病病毒核蛋白单抗(1100稀释,37孵育30min; PBS洗涤3次,每孔加入2滴80%甘油,倒置荧光显微镜下观察每孔荧光病变情况。结果判定:病毒对照孔应达到80%95%的细胞呈现荧光染色病灶;细胞对照应无荧光病灶;参考品A/B中和效价应在设定的范围内,依次读取待检样品各稀释度荧光病灶的百分率;记录标准品、参考品及血清或免疫球蛋白样品荧光病灶在50%上下的两个稀释度,并与已知效价的参考品对照,计算出待检血清效价,采用SPSS统计软件计算结果。荧光灶模式见图1。1.5小鼠脑内中和法参照中国药典三部(2005版方法进行。1.6R

15、FFIT法与MNT法的精密性分析分别用RFFIT法和MNT法对我国第5批狂犬病毒免疫球蛋白国家标准品(由国家第4批抗狂犬病病毒抗体标准品标定进行多次重复标定(以第3批国际标准品为标准,其中MNT法进行25次重复测定,RFFIT法进行12次重复测定。同时为验证RFFIT法在不同实验室间操作的重现性,由法国巴斯德研究所采用RFFIT法,对我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品进行10次重复标定(以法国国家抗狂犬病病毒血清标准品和第3批国际标准品为标准。对结果进行统计学分析。A:阴性细胞对照;B:与病毒对照相比较,能抑制50%病毒的最高稀释度血清;C:病毒对照图1单克隆抗体标记的荧光素染色的荧光灶模式

16、Fig1.Mode of fluorescence focus of stained McAb against rabies neucleoprotein labeled with fluorescence1.7RFFIT法与MNT法的相关性分析采用RFFIT和MNT两种方法检测19份ERIG 和HRIG样品和15人接受人用狂犬病疫苗免疫前、免疫后14d、45d的45份血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,并采用秩和检验进行相关性统计学分析。1.8统计学分析采用SPSS11.0软件进行统计学分析,所得数据进行配对秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1RFFIT法与MNT

17、法的精密性以第3批国际标准品为标准,分别用MNT法和RFFIT法对我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品进行重复标定,结果MNT法25次结果的几何均值(GMT为21.4IU/ml,RFFIT法12次结果的GMT 为23.8IU/ml,两种方法的变异系数(CV分别为62.3%和13.3%,表明RFFIT法的精密性优于MNT 法。不同实验室间的重现性验证结果显示,法国巴斯德研究所和中国药品生物制品检定所测定我国第5批国家标准品,结果的几何均值差异无统计学意义(P>0.05,显示两研究所以不同的标准品分别对我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品的标定结果非常一致,其中法国巴斯德研究所测定的结果更接

18、近我国以MNT法所标定的值,见表1 。A B C表1两个实验室使用不同标准品测定我国第5批狂犬病免疫球蛋白国家标准品的效价GMT值(IU/mlTab1.GMTs of the fifth batch of national standard for ra-bies immunoglobulin determined by two laboratories using different standards for rabies immunoglobulin(IU/ml法国巴斯德研中国药品生物制究所(n=10品检定所(n=12法国国家抗狂犬病21.36/病毒血清标准品第3批国际标准品21.712

19、3.812.2RFFIT法与MNT法的相关性RFFIT法与MNT法检测19份ERIG和HRIG 样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,结果差异无统计学意义(P=0.059,见表2,相关系数为0.962,表明两种方法的检测结果之间相关性良好。两种方法检测结果的散点图见图2。两种方法检测15人接受人用狂犬病疫苗免疫前、免疫后14d和45d的45份血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价结果见表3,将免疫后14d和45d的29份血清抗体检测结果(除去A1样品,因两种方法检测结果不一致与19份ERIG和HRIG 样品效价数据合并分析,两种方法的检测结果差异无统计学意义(P=0.902,相关系数为0.976,表明两

20、种方法检测结果之间呈良好的正相关性。两种方法检测结果的散点图见图3。表2RFFIT和MNT法测定ERIG和HRIG样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价的比较Tab2.Determination of neutralizing antibody potencies against rabies virus in ERIG and HRIG by RFFIT and MNT血清样品RFFIT法(IU/mlMNT法(IU/ml L1107.20131.0L2108.11134.0L3231.30195.2L4158.20172.0L558.5877.1L680.3873.6L758.5670.0L864.

21、2075.9L994.3089.2L1036.9537.2L1127.8025.4L1227.8025.5L13114.00138.0L14153.00143.0L15146.00132.0L1648.5069.0L1751.5074.0L18383.00537.0L1952.5068.0表3RFFIT和MNT法检测免疫前后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价的比较Tab3.Determination of neutralizing antibody potencies in human sera before and after immunization by RFFIT and MNT血清样

22、品RFFIT法(IU/mlMNT法(IU/ml 10.070.230.07<0.550.07<0.560.09<0.590.07<0.5100.07<0.5110.09<0.5210.13<0.5290.09<0.5320.09<0.5390.09<0.5400.19<0.5450.19<0.5500.19<0.5610.09<0.5A10.890.3A3 4.78 1.23A5 4.120.66A6 3.66 4.17A9 4.8617.0A10 5.21 1.32A117.13 4.17A21 6.51 1

23、.66A29 5.42 1.32A3212.3613.5A39 4.860.91A40 5.42 1.32A4519.5317.0A508.79 1.91A61 4.86 1.23B1 2.38 2.09B3 3.69 1.32B5 2.77 2.63B6 1.040.8B9 2.770.8B10 2.87 1.32B117.96 2.63B21 3.760.8B2911.2921.4B327.96 3.81B39 6.72 6.61B407.13 2.63B4523.8930.2B50 5.38 1.32B61 3.69 1.32注:161:免疫前的血清抗体效价;A1A61:免疫后14d的血

24、清抗体效价;B1B61:免疫后45d的血清抗体效价参照品图2RFFIT 法与MNT 法检测19份ERIG 和HRIG 样品抗狂犬病病毒中和抗体效价结果的散点图Fig 2.Scatter diagram of neutralizing antibody poten -cies against rabies virus in 19ERIG /HRIG samples deter -mined by RFFIT and MNT图3RFFIT 法与MNT 法检测19份ERIG 和HRIG 及29份免疫后血清样品抗狂犬病病毒中和抗体效价结果的散点图Fig 3.Scatter diagram of neu

25、tralizing antibody poten -cies against rabies virus in 19ERIG /HRIG samples and 29serum samples after immunization determined by RFFIT and MNT3.讨论RFFIT 法检测抗狂犬病病毒中和抗体的基本原理是将狂犬病攻击病毒与待检血清混合,体外中和一定时间,将混合物接种细胞,培养24h 后,用荧光标记的抗狂犬病病毒核蛋白单抗进行染色,如待检样品中含具有中和活性的抗体,病毒可被中和而荧光染色呈阴性或减少,样品中无具有中和活性的抗体则荧光染色呈阳性。该方法可在抗体标

26、准品平行实验的基础上评价样品的中和抗体效价6。狂犬病病毒在细胞中培养时的复制周期为1620h ,因此实验时检测到的病毒是未被中和、在细胞中培养的第1代子代病毒。在实验时选择抗狂犬病病毒核蛋白的单抗,是由于狂犬病病毒的核蛋白在复制过程中最先被转录和复制,在病毒的复制过程中首先与病毒RNA 结合,形成核糖核蛋白,结构稳定,而且核蛋白的量占狂犬病病毒总蛋白的36%以上7,容易被检测到。RFFIT 法实验时采用96孔细胞培养板,为样品的稀释提供了条件,本文结果显示,其测定的抗体水平可达0.1IU /ml 以下,而MNT 法由于小鼠使用量的限制,待测样品稀释度同样受限,因此其抗体检测限只能达到0.2IU

27、 /ml 的水平,表明RFFIT 法的敏感性较MNT 法好。本文对疫苗免疫后14d 的血清抗体进行检测时,对疫苗应答水平较低的个体的血清样品(A1用MNT 法检测达不到有效保护的水平(0.5IU /ml ,但应用RFFIT 法检测,该样品则达到了有效保护水平(0.89IU /ml ,表明RFFIT 法的敏感性高于MNT 法,与文献报道一致5,8。综上所述,RFFIT 实验时间短(只需2d ,可同时进行大量样本的检测,不需使用动物,符合动物实验3R 原则;而且已经国际上众多实验室的验证,并得到WHO 的强力推荐。因此,该方法将成为我国检测ERIG /HRIG 效价的法定方法,本研究为此提供了重要

28、的数据支持。参考文献1方喜业,邢瑞昌,贺争鸣.实验动物质量控制.北京:中国标准出版社,2008:1312.2WHO Expert Committee on Biological Standardization.Recommen -dations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs,Fifty -sixth report /WHO Ex -pert Committee on Biological Standardization.WHO TRS 941,2007.3WHO Expert Consultation on Rabies,First Report.WHO TRS 931,2005.4Louie RE,Dobkin MB,Meyer P,et al.Measurement of rabies anti -body:comparison of the mouse neutralization t