蛋白质变复性

1、目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化 710四、包涵体提出、纯化和复性魔和盐厭弧任包涵休蛋白质提纯中的作用变性剂如服和盐酸肌等可使蛋白质结构中的氢键发生断裂,这增加了非极性分了包拆氨基酸侧链的沽寳氐械少了疏水相互作用；腺还可以棵入到贺白质分予的内部感响茨白质分子的密堆枳口此外，去污剂、有机溶剂.重金属*热、机械力*冷冻、超声、isjffi,辐射等均可引起蛋白质的变性乜这些变性均不会破坏蛋白质的共价键而能只涉及到氢键、盐键、疏水相 互作用.范得华柑互作用等次级键的破坏。有些变性的蛋白质半变性闵素被除去后又可自动 地恢复到天然状風这种现象称为蛋口质的复性（

2、renaturation）,这种复性即蛋白质折疊研 究中的重折叠（refolding） B （1931年吴宪提出的蛋白质变住学说）包涵体蛋白质捷纯大多数任PH8的条件下，一般用強的变性剂如尿索（F8n皿几）、盐酸肌（GdnHCl 5*8mol/L 或6mol.l） t通过离了间的和互作用，打断包涵体蛋白质分了内和分子间的各种化学键， 便多肽伸眩般来讲，盐颤优于尿爲因为盐輒是较尿素强的变性剂，它能使尿素不 能溶解的包涵体蒋解*而且尿素分解的异鼠霞盐能导致多肽链的自山氯基甲酰化，特别是在 碱性pH值下长期保温时或用去垢剂，5HS0S.止十六烷皋三甲基钱氯化物.Sarkosyl, 可以破坏货白内的疏

3、水键*也可溶解 些包涵休伐白质。用Tr辻onX-100来落解Zymononas Diobilis levansucrase涵体蚩口暫另外，对丁倉有半胱氨酸的蛋白质*分离的包涵休中 逋常介有些链间形成的疏键和链内的非材性硫犍口还有有机落剂、碱性环境（大丁 9） 或酸（了鹅甲酸也可便之溶解锂变性液中需加入还从剂，如2蔬基乙醇（B-ME）、 硫苏糖醛（irm*硫赤还廉型的谷胱甘肽（GST）.半胱氮酸$还原剂的使用哝度 般StblOOtoM pME或DTT, 也有文I就使用5mM浓配还廉剂的使用浓度与蛋白：硫键的数目无关而有些没有備键的 贺口加不加还療剂无影响*如牛生艮激素包涵体的增溶。对丁目标蛋白没

4、有硫键某些包滴 体的增溶，有时还硕剂的便用也是必耍的，可能山于含工硫键的杂蛋白够响了包涵体的溶解. 同时还需加入金屈整合剂如EDTA或EGTN以番合Cu吐FQ辔金屈离子，防止已经处于还 原状态的蔬基与之发生氧化反应 变性剂擀解店.蛋白质失去了生物学活性.、 包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、 RNA 聚合酶、 内毒素、 外膜蛋白 ompC、 ompF 和 ompA 等， 环状或缺口的质粒 DNA ，以及脂体、脂多糖等。基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌 洗涤

5、 溶解目录1 包涵体2 包涵体变性3 包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、 RNA 聚合酶、 内毒素、 外膜蛋白 ompC、 ompF 和 ompA 等， 环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为 0.5-1卩m，具有很高的密度（约1.3mg/mL） ，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 NMR 等新技术的应 用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适， 无法形成正确

6、的次级键等原因形成的。1基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的3因子的蛋白水解能力达到饱和， 使之表达产物积累起来。 研究发现在低表达时很少形成包涵体， 表达量越高 越容易形成包涵体。 原因可能是合成速度太快， 以至于没有足够的时间进行折叠， 二硫键不 能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2. 重组蛋白的氨基酸组成 :一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。3. 重组蛋白所处的环境 :发酵温度高或胞内 pH 接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻

7、译后修饰所需酶类和辅助因子， 如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。5. 蛋白质在合成之后，于中性pH 或接近中性 pH 的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase表达产率达菌体蛋白的 30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。6. 在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵 体的形成。包涵体变性破菌基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用 :机械破碎、超声破碎 :单纯超声破碎，在小规模下 且菌量较少的情况下效果较好， 由于能量传递和局部产热等原因， 很难用于大体积

8、细胞悬液 的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起， 给后期纯化带来困难。因此，在较大规模 纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜， 再结合超声破碎方法， 可显著提高包涵体的纯度和回 收率。以及化学方法破碎使细菌裂解 ,然后以 5000-20000g 15min 离心， 可使大多数包涵体沉 淀，与可溶性蛋白分离。洗涤溶解一般用强的变性剂如尿素 (6-8M) 、盐酸胍 (GdnHCl 6M) ，通过离子间的相互作用，打断包涵 体蛋白质分子内和分子间的各种化学键， 使多肽伸展，一般来讲， 盐酸胍优于尿素，因为盐 酸胍是较尿素强的变性剂， 它能使尿素不能溶解的包涵体溶解， 而且尿素分解的异氰酸盐能 导致

9、多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性 pH 值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、 Sarkosyl 等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha 等人用 TritonX-100 来溶解 Zymononas mobilis levansucrase 包涵体蛋 白。另外还， 对于含有半胱氨酸的蛋白质， 分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键 和链内的非活性二硫键。 还需加入原剂， 如巯基乙醇、 二硫基苏糖醇 (DTT) 、二硫赤藓糖醇、 半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度

10、。在较粗放的条件下，可以使用 5ml/l 的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关， 而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响， 如牛生长激素包涵体的增溶。 对于目标蛋白 没有二硫键某些包涵体的增溶， 有时还原剂的使用也是必要的， 可能由于含二硫键的杂蛋白 影响了包涵体的溶解。包涵体复性由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性， 加上剧烈的处理条件， 使蛋白的高级结构破 坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态 恢复到正常的折叠结构， 同时去除还原剂使二硫键正常形成。 一般在尿素浓度 4M 左右时复 性过程开始，到 2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，

11、可以从 4M 开始，到 1.5M 时复性过程 已经结束。包涵体蛋白复性方法包涵体蛋白复性效率复性是一个非常复杂的过程， 除与蛋白质复性的过程控制相关外， 还很大程度上与蛋白质本 身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰 RNA 酶有 12 对二硫键，在较宽松的条件 下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11 ，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几，如在纯化 IL-2 时以十二烷基硫酸钠溶液中 加入铜离子 (0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2) 的方法， 25-37C 下反应 3小时，再 EDTA 至 1m mol/l 终止反应

12、，复性后的二聚体低于1%。6一般说来， 蛋白质的复性效率在 20%左右。影响复性效率的因素蛋白质的复性浓度 :正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质 的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而，一般浓度控制在 0.1-1mg/ml; 如果变性蛋白加入 复性液中过快， 容易形成絮状沉淀， 可能是蛋白重新凝聚的缘故。 所以我们采用再水浴和磁 力搅拌下， 逐滴加入变性蛋白 ，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。pH 和温度 :复性缓冲液的 pH 值必须在 7.0 以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响 正确配对的二硫键的形成， 过高或过低会降低复性效率， 最适宜的复性 pH

13、 值一般是 8.0-9.0。此外，影响复性效率的因素还有， 变性剂的起始浓度和去除速度、 氧化还原电势、 离子强度、 共溶剂和其他添加剂的存在与否等。提高包涵体蛋白的复性产率氧化 -还原转换系统对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有 : 空气氧化法、使 用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及 DTT 再氧化法 .最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG,而 cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG 等也都有应用。 氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高 了正确配对的二硫键的

14、产率。通常使用 1-3m mol/l 还原型巯基试剂 ,还原型和氧化型巯基试 剂的比例通常为 10:1-5:1。添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠， 但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性， 或 增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。 如盐酸胍、脲、 烷基脲、以及碳酸 酰胺类等， 在非变性浓度下是很有效的促进剂。 蛋白质的辅因子、 配基或底物亦可起到很好 的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体，从而防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于 0.4 mol/lTris 缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。浓度为 0.4-0.6M L-Ar

15、g 有助于增加复性中间产物的溶解度。成功的应用于很多蛋白如t-PA 的复性中，可以抑制二聚体的形成。PEG-NaSO4 两相法用 PEG 和 NaSO4 作为成相剂 ,然后加入盐酸胍，再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进 行复性 ,但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须低。分子伴侣和折叠酶等这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰 -辅氨酰顺反异构酶、 分子伴侣、 FK506结合蛋白、 Cyclophilin 等。 分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过 程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。其它提高复性率的策略还有许多，如 : 非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性

16、离子去垢剂或表面 活性剂 CHAPs 、 Triton X-100 、磷脂、 laury lmaltosid 、Sarkosyl 等对蛋白质复性有促进作用 ; 待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性;多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。 10折叠复性效果的检测根据具体的蛋白性质和需要， 可以从生化、 免疫、 物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行 检测。凝胶电泳 :一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或 用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。光谱学方法 :可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱

17、(CD) 等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。色谱方法 :如 IEX 、RP-HPLC 、 CE 等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，生物学活性及比活测定 :一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活 性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。黏度和浊度测定 :复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很 差，大多形成可见的沉淀析出。免疫学方法 :如 ELISA 、 WESTERN 等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映 了蛋白质的折叠状态。在正常的生理条件下， 组

18、成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠， 形成自己特有的空 间结构， 以执行某一些生命活动。 当外界环境改变时， 可能造成基因突变和蛋白质序列改变， 错误剪接和运输， 错误折叠和异常聚积， 形成对机体有害的反应， 引起构象病的发生和无生 物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚， 许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的， 且没有普遍性， 但从这许 许多多的个例中发现了一些规律 :如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相 对特异性、 折叠中间体可能具有不同的作用等等， 并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高 效复兴性的方法。 相信

19、随着结构生物学、 生物信息学、 蛋白质工程学及相关新技术和新设备 的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。3.包涵体的洗涤纯化1 包涵体洗涤试剂1.1 裂解液 50mmol/L Tris Cl （ pH7.2） , 10mmol/L EDTA , 300mmol/L NaCl. 。1.2 Buffer I 20mmol/L Tris-HCl ， 5mmol/L EDTA， 100mM NaCl。1.3 2M/4M/8M 尿素溶液 分别称取 2mol/4mol/8mol 的尿素，用Buffer I 定容至 1L 即可。2 工程菌的大量表达 从平板上挑生长饱满的单克隆菌落接种

20、于25ml LB （含抗生素），37 C振荡培养过夜。将培养菌液按1:1000扩 种，至装有500ml LB （含抗生素）的1000ml三角培养瓶中，培养的 瓶数根据需要而定。37C振荡培养，至0D600nm 1.0左右。使菌液 冷却，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L, 25C，诱导6hr。收集菌体， 4C, 10,000g离心4min。以培养液体积的1/50量的裂解液悬浮。冰 浴，用超声破碎仪或高压均质机破碎菌体。超声条件为：输出功率70%，作用2sec、间歇4sec为一个脉冲，共 作用时间累计 30min/100ml 裂解液。同时保留上清和沉淀部分，分别 制样进行SDS-PAGE分析

21、。3 包涵体的洗涤纯化包涵体沉淀以裂解液等体积的 2% Triton X100（Buffer I 溶解） 重悬，37C，振荡30min。4C, 8,000g,离心10min，沉淀以等体积的Buffer I重悬，超 声波处理 5min/100ml 悬浮液。4C,8,000g,离心 10min，沉淀以等体积的 2% Triton X100（Buffer I 溶解）重悬，37C，振荡 30min。4C, 8,000g，离心 10min,沉淀以等体积的Buffer I重悬，37C,振荡30min。4C, 8,000g，离心10min,沉淀以等体积的2mol/L尿素溶解， 室温搅拌 30min。4C,

22、8,000g，离心10min,上清液为目的蛋白的2M尿素样品； 沉淀以等体积的 4mol/L 尿素溶解,室温搅拌 30min。 SDS-PAGE 检 测目的蛋白所在组分。4C, 8,000g，离心10min，上清液为目的蛋白的4M尿素样品； 沉淀以等体积的 8mol/L 尿素溶解,室温搅拌 30min。 SDS-PAGE 检 测目的蛋白所在组分。4C, 12,000g,离心10min,上清液为目的蛋白的8M尿素样品， SDS-PAGE检测目的蛋白所在组分。蛋白样品基本上都能溶解于 8M 尿素,弃沉淀。4 蛋白质的复性方法4.1 透析复性 将包涵体的 4M 尿素变性置于透析袋中,注意透析 袋中尽

23、可能不留气泡,再将透析袋放入装有 20 倍以上蛋白样品体积 的复性液（如PBS溶液）的烧杯中，在预设环境温度（4C、25C和 37 C等）下，用磁力搅拌器中速地搅拌复性液，以加速溶液的渗透和 扩散。每隔一定的时间（4C时约3-4hr, 25C, 27C约2-3hr）换一 次等量新鲜的复性液，共4次。透析袋内的样品经4C, 12,000g，离 心10min,上清即为目的蛋白的复性液，沉淀视情况进行回收再复性。 如透析至PBS中样品沉淀了，可以逐步透析至 4M尿素，2M尿素， PBS 中。复性液可进一步用其它方法进行检测,短期保存可贮存于 4C,常期保存则置于-20C或-80Co4.2 切向流复性

24、 根据目的蛋白的分子量,选择膜包的合适截留 分子量（常用的有 5kD、10kD 和 30kD 等）,按仪器的操作说明将膜 包、样品容器和压力计用无吸附硅胶软管相连, 其中的部分软管绕过 蠕动泵。根据膜包的洗涤程序,用规定的溶液洗涤膜包,最后以蛋白 变性液的溶剂平衡管道系统，将预过滤（0.22 m的微孔滤膜过滤） 的样品液（包括复性添加剂等）倒入样品容器中,若有需要,开动蠕 动泵将样品的蛋白浓度浓缩到预定的值。 整个系统, 包括样品和复性 缓冲液，预先平衡至预定的环境温度（4C、25C和37C等），将复 性缓冲液连入系统的滤过液补偿接口, 开动搅拌系统, 缓慢启动蠕动 泵至 1L-1.2L/mi

25、n 的流速,测量切向滤过液的流速,调节系统反压阀 以控制滤过速度达到预期值, 并确认复性液被滤过造成的负压吸入以 更换变性缓冲液。待滤过液的体积达到 20 倍样品的体积时,撤离复 性缓冲液，回收样品经4C, 12,000g,离心10min,上清即为目的蛋 白的复性液,沉淀视情况进行回收再复性。 按规定洗涤膜包的残留物, 并将膜包充满含0.05%NaN3的弱碱性溶液，存放于4C。复性液可进一步用其它方法进行检测，短期保存可贮存于 4 C,常期保存则置 于-20C或-80Co若带GST标签的目的蛋白表达在上清中，可以选择过 GST 柱。若表达在包涵体中，可以通过洗包涵体，复性纯化。 若需进一步提高

26、纯度， 可以采用电洗脱方法纯化， 但电洗脱纯化的蛋 白是变性用且不可复性的。可以尝试改用 PET32a载体表达，目的蛋 白表达至上清中的可能性将提高。四、 包涵体提出、纯化和复性 下列方法已在本实验室验证， 复性任何包涵 体，必定能得到目的蛋白：菌体为超声法裂解，裂解溶液中含50mM Tris-HCl, pH 8.0 ，100mM NaCl ，5mM EDTA ，0.1% NaN3 ，0.5% Triton-X100 ，在使用前加入 0.1mM PMSF每 250 毫升裂解液中加入约 50 克菌体，工 作 15s ，间隔 15 秒，超声破碎 45 分钟，超 声后加入 10mM MgSO4 和

27、0.1mg/ml 的 溶菌酶和 Dnase 0.01mg/ml ，室温放置 20 分钟， 6000RPM 离心 15 分钟，保留沉淀。再次加入裂解液， 超声破细胞后， 加溶菌酶 和 Dnase, 上述过程重复三次。100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN3用下述溶液悬浮包涵体，离心收集包涵体。50mM Tris-HCl, pH 8.0100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN31M 尿素如暂时不用，放入20 C保存。包涵体的溶解将包涵体悬浮在下述溶液中， 4 C振荡过夜。100mM Tris50mM Glycine8.5M 尿素溶液用 HCl 调节到 pH 8.0 后加入25mM DTT用下述的溶液将包涵体悬浮， 离心收集包涵 体。6000RPM 离心，取上清，去除不溶解物。将溶解的包涵体装入透析袋，在4 C下将