第一讲：遗传物质——DNA与RNA

1、DNA与RNAn 生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理功能上常常生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理功能上常常相似，这就是相似，这就是遗传现象遗传现象。n 生物的遗传特性，使生物界的物种能够保持相对稳定。生物的遗传特性，使生物界的物种能够保持相对稳定。 根据现代细胞学和遗根据现代细胞学和遗传学的研究得知，控制生传学的研究得知，控制生物性状的主要遗传物质是物性状的主要遗传物质是脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）。）。 生物的各项生命活动都有生物的各项生命活动都有它的物质基础。生物遗传的物它的物质基础。生物遗传的物质基础是什么呢？质基础是什么呢？金丝猴的后代仍然是金丝猴金丝猴的后代仍然是金丝

2、猴牛的后代仍然是牛牛的后代仍然是牛 （1）储存并表达遗传信息）储存并表达遗传信息: （2）能够复制，把遗传信息传递给子代：）能够复制，把遗传信息传递给子代： (3) 物理和化学稳定性：物理和化学稳定性： （4）有遗传变化的能力：）有遗传变化的能力：遗传物质必须具备以下基本条件：遗传物质必须具备以下基本条件：核酸（DNA、RNA）的化学组成知识点 1嘧啶嘧啶嘌呤嘌呤1 含氮碱基、核苷、核苷酸含氮碱基、核苷、核苷酸 碱基碱基HUracil (U)DNA: D-2-脱氧核糖脱氧核糖 A,G,C,TRNA: D-2-核糖核糖 A,G,C,Un 核酸的元素组成C、H、O、N、P（9-10%） 核酸核酸

3、核苷酸核苷酸 磷酸磷酸 核苷核苷 戊糖戊糖 碱基碱基3 DNA的一级结构：的一级结构：即是指即是指四种核苷酸四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列顺序，通按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸也称为碱基顺序。多核苷酸也称为碱基顺序。DNADNA一级结构的两种缩写方式：一级结构的两种缩写方式：v 线条式：线条式： pTpGpCpApT pTpGpCpApT pT-G-C-A-T pT-G-C-A-Tv 文字式：文字式：1 DNA双螺旋模型的提出2 维持DNA双螺旋的力3 双螺旋结构的基本形式4 变性和复性知识点 2研究背景：研究背景

4、：p1950年，大量不同来源年，大量不同来源DNA样品的分析发样品的分析发现了现了DNA组成的组成的当量规律当量规律，即，即AT，GC，AGCT。 不同生物种属的不同生物种属的DNA碱基组成不同，碱基组成不同， 同一个体不同器官、不同组织的同一个体不同器官、不同组织的DNA具有具有相同的碱基组成。相同的碱基组成。1 DNA双螺旋模型的提出双螺旋模型的提出 理论化学家L. Pauling运用化学的简单定律来推理，研究了蛋白质-螺旋结构，此方法启发了Watson和和 Crick。 M. Wilkins、R. Franklin等在DNA的X射线晶体结构方面作出了重大的贡献。 R. Franklin的

5、X-射线衍射图1953年沃森和克里克提出年沃森和克里克提出DNA分子双螺旋结构模型。分子双螺旋结构模型。DNA双螺旋结构模型的提出：Fig. 2-5 Watson and Cricks paper in Nature 1953.DNA双螺旋结构模型的要点：双螺旋结构模型的要点： 脱氧核糖和磷酸通过脱氧核糖和磷酸通过3,5磷酸二酯键交磷酸二酯键交互连接，成为螺旋链的互连接，成为螺旋链的骨架。骨架。 两条链方向以两条链方向以反向平行反向平行的方式组成的方式组成右手右手双螺旋双螺旋。 碱基互补配对：碱基互补配对：只有A和T配对，G和C配对才能满足正常螺旋（直径20 ）的要求和chargaff的当量规

6、律。 螺旋参数螺旋参数螺旋直径螺旋直径nm。螺旋每旋转一周螺旋每旋转一周10对碱基，对碱基，每个碱基的旋转角度为每个碱基的旋转角度为36。螺距螺距3.4nm；碱基平面之间的距离为碱基平面之间的距离为0.34nm。 大沟小沟大沟小沟 对于遗传上有重要功能的对于遗传上有重要功能的蛋蛋白质识别白质识别DNA双螺旋结构上双螺旋结构上的特定信息是非常重要的。的特定信息是非常重要的。p大沟大沟(2. 2nm)p小沟小沟(1. 2nm)2 维持DNA双螺旋的力氢键氢键 GC之间有三条氢键，之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，这是之间有两条氢键，这是DNA双螺旋结构的重要双螺旋结构的重要特征之一，特征之一，D

7、NA的许多的许多物理性质物理性质如变性、复性以如变性、复性以及及Tm值值等都与此有关。等都与此有关。碱基堆集力碱基堆集力 DNA同一条链相邻碱基同一条链相邻碱基之间的非特异之间的非特异性作用力，包括性作用力，包括疏水作用力和疏水作用力和范德华力范德华力。 疏水作用力：疏水作用力：不溶于水或难溶于水的两个分子在不溶于水或难溶于水的两个分子在水中具有相互联合，成串联地结合在一起的趋势。水中具有相互联合，成串联地结合在一起的趋势。 嘌呤和嘧啶有一定程度的疏水性，双螺旋结嘌呤和嘧啶有一定程度的疏水性，双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，构内部形成一个强大的疏水区，使使DNA相邻的碱相邻的碱基有相互堆集

8、在一起的趋势，这是形成碱基堆集基有相互堆集在一起的趋势，这是形成碱基堆集力的重要因素之一。力的重要因素之一。 范德华力：范德华力：存在于分子间的一种吸引力；存在于分子间的一种吸引力； DNA双链中嘌呤双链中嘌呤环环和嘧啶和嘧啶范环德华的范环德华的半径是半径是1.7 左右左右 ，其累积的，其累积的范德华力范德华力是相是相当可观的，这当可观的，这样范德华力加强了疏水作用，样范德华力加强了疏水作用，这是形成碱基堆集力的另一个重要因素。这是形成碱基堆集力的另一个重要因素。 氢键与碱基堆集力的氢键与碱基堆集力的协同作用协同作用 已经堆基的碱基更容易发生氢键的键合，已经堆基的碱基更容易发生氢键的键合，相应

9、地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。相应地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。 两种作用力相互协同，形成一种非常稳定两种作用力相互协同，形成一种非常稳定的结构。如果一种作用力被消除，另一种的结构。如果一种作用力被消除，另一种作用力也大为减弱。作用力也大为减弱。 磷酸基团间的静电斥力磷酸基团间的静电斥力 带负电荷的磷酸基的带负电荷的磷酸基的静电斥力静电斥力，所以，所以DNA 碱基分子内能碱基分子内能 p 物体的内能是物体内全部分子的分子动能物体的内能是物体内全部分子的分子动能与分子势能之和。与分子势能之和。p 温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏，消

10、弱了碱基的氢键结定向排列遭受破坏，消弱了碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，会使合力和碱基的堆集力，会使DNA的双螺旋的双螺旋结构受到破坏。结构受到破坏。不稳定因素不稳定因素3 双螺旋结构的基本形式 三种不同形式的三种不同形式的DNA构象构象 A，B，Z型双螺旋的特性双螺双螺旋类旋类型型直直径径(nm)螺螺距距(nm)每轮每轮碱基碱基数数碱基碱基间距间距(nm)碱基碱基倾角倾角 ()螺旋螺旋扭角扭角()存在的条件存在的条件沟型沟型相对相对湿度湿度盐种类盐种类大沟大沟小沟小沟A2.32.8110.26133375%Na+、K+、Cs+窄，深窄，深宽，深宽，深B2.03.410.40.3403692%

11、Na+低盐低盐宽，中宽，中等深等深窄，中窄，中等深等深Z1.84.6120.389-3043%Na+、Mg2+高盐高盐平浅平浅窄，深窄，深ABZ大沟宽大沟宽小沟窄小沟窄小沟窄小沟窄大沟变深大沟变深小沟宽深小沟宽深大沟不存在大沟不存在小沟窄而深小沟窄而深 A构象构象:在相对湿度在相对湿度75以下获得的以下获得的DNA纤维具有不同与纤维具有不同与B-DNA的结构特点。的结构特点。DNA-RNA杂交分子和杂交分子和RNA-RNA双链结双链结构均采取构均采取A构象。构象。 Z-DNA的形成是的形成是DNA单链上出现嘌呤和单链上出现嘌呤和嘧啶交替排列所造成的，比如嘧啶交替排列所造成的，比如CGCGCGC

12、G或或CACACACACA。Z-DNA有什么生物学意义呢有什么生物学意义呢? Z-DNA在热力学上是不利的。带负电荷的磷在热力学上是不利的。带负电荷的磷酸根距离太近，产生静电排斥。酸根距离太近，产生静电排斥。 DNA链的链的局部不稳定区的存在就成为潜在的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点解链位点。 DNA解链是解链是DNA复制和转录等过程中必要复制和转录等过程中必要的环节，因此的环节，因此Z-DNA的结构与基因调节有的结构与基因调节有关。关。 B-DNA是活性最高的是活性最高的 DNA构象，构象， B-DNA变构成为变构成为A-DNA后，仍有活性，后，仍有活性，但若局部变构为但若局部变构为

13、Z-DNA后则活性明显降后则活性明显降低。低。三种不同构象的三种不同构象的DNA活性活性变性和复性 变性 概念：概念：在某些理化因素作在某些理化因素作用下，用下，DNA分子互补碱基分子互补碱基对之间的氢键断裂，对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结构松散，变成单双螺旋结构松散，变成单链的过程链的过程。常用的变性方法常用的变性方法 热变性热变性 碱变性碱变性应用广泛，特别是用于变性动力学研究应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链短不一的单链pH11.3时，全部氢键被淘汰时，全部氢键被淘汰无热变性的缺点，为制备单链无热

14、变性的缺点，为制备单链DNADNA的首选方法的首选方法 核酸变性程度的鉴定核酸变性程度的鉴定紫外测定法：紫外测定法： 原理：原理：嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处。处。 紫外光吸收值：紫外光吸收值： 1 双链双链DNA A260=1.00 2 单链单链DNA A260=1.37 3 自由碱基自由碱基 A260=1.601.1851.01.37OD Tm = OD增加值的中点温度增加值的中点温度(一般为一般为85-95) 或或D

15、NA双螺旋结构失去一半时的温度双螺旋结构失去一半时的温度熔解曲线与熔解曲线与Tm值值 缓慢而均匀地增加缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到溶液的温度（现可做到 0.1 分分）可根据各点的可根据各点的A260值绘制成值绘制成DNA的熔解曲线。的熔解曲线。 这也是一般这也是一般PCRPCR实验技术中把变性温度定为实验技术中把变性温度定为9494的原因的原因 熔链温度熔链温度Tm影响DNA Tm值大小的因素： DNA的均一性：的均一性： G-C含量：含量： Tm值计算公式：值计算公式：Tm69.3+0.41 (G+C)% GC%=（Tm-69.3）2.44 介质中的离子强度：介质中的离子强度：

16、 DNA保存在高浓度的缓冲液中，如保存在高浓度的缓冲液中，如 1mol/LNaCl中。中。复性及杂交DNA复性复性 变性变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象，又称为构象的现象，又称为退火退火。 DNA的复性的条件有两个的复性的条件有两个：（1）有）有足够的盐浓度足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥以消除磷酸基的静电斥力；力；（2）有）有足够高的温度足够高的温度以破坏无规则的链内氢以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高，键，但又不能太高， 一般使用一般使用比比Tm值低值低2025 。

17、复性的机制复性的机制 一般认为需要一般认为需要1020个碱基对个碱基对，特别是富，特别是富含含GC的节段首先形成一个（或几个）双的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫螺旋核心，这一步叫成核作用成核作用。然后两条。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构。单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构。 绝大部分的复性绝大部分的复性DNA分子都不是原配的。分子都不是原配的。复性的影响因子： 温度和时间温度和时间：低于低于Tm值值 25左右左右 (60-65) DNA浓度浓度： DNA片段的大小片段的大小： DNA顺序的复杂性顺序的复杂性； 反应溶液中的离子强度反应溶液中的离子强度。 多聚酶链

18、式反应（多聚酶链式反应（ PCR） 是一种是一种DNA体外扩增技术体外扩增技术，其基本原理类，其基本原理类似于似于DNA的的天然复制过程天然复制过程。 在待扩增的在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸的两个寡核苷酸引物引物，经，经变性、退火和延变性、退火和延伸伸若干个循环后，若干个循环后，DNA扩增扩增2n倍。倍。 杂交 杂交：杂交：亲缘关系很近亲缘关系很近的不同来源的的不同来源的DNA单单链或链或RNA单链与单链与DNA单链之间通过碱基互单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过补形成杂交分子的过程。程。图核酸杂交及其应用示意图图核酸杂交及其应用示意图1粗细线粗

19、细线分别代分别代表不同表不同DNA。 杂化双链杂化双链B代表天然代表天然DNA；C是是B的缺失突变的缺失突变体；虚线框体；虚线框内是已缺失内是已缺失的部分的部分,D显显示从天然示从天然DNA链鼓出链鼓出小泡小泡.突变体的鉴别突变体的鉴别I 变性、复性和杂交变性、复性和杂交 .分子探针标记 核酸分子探针：核酸分子探针： 用同位素、生物素或荧光染用同位素、生物素或荧光染料料标记一小段已知核苷酸序列标记一小段已知核苷酸序列作为探针，探作为探针，探针的序列如果与针的序列如果与DNA或或RNA序列互补，就可序列互补，就可以探知核酸分子。以探知核酸分子。粗线表示分子探针粗线表示分子探针图核酸杂交及其应用示

20、意图图核酸杂交及其应用示意图2杂交分类：杂交分类：1）液相杂交：）液相杂交：不同来源的不同来源的DNA在溶液中进行杂在溶液中进行杂交。交。2) 滤膜杂交：滤膜杂交：将将DNA或或RNA吸附到硝酸纤维素吸附到硝酸纤维素膜上再进行杂交。膜上再进行杂交。 Southern杂交：杂交：用于鉴别用于鉴别DNA的杂交的杂交 Northern杂交：杂交：用于鉴别用于鉴别RNA的杂交的杂交Southern 印迹法：印迹法：DNA限制片段限制片段限制性内切酶限制性内切酶带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱液浸泡，并中和碱液浸泡，并中和凝胶上凝胶上DNA变性变性变性的单链变性的单链DN

21、A转移转移至硝酸纤维素薄膜上至硝酸纤维素薄膜上放射性标记探针杂交放射性标记探针杂交杂交杂交DNA-DNA分子分子放射自显影放射自显影显示出杂交分子的位置显示出杂交分子的位置1、二级结构的其他形式二级结构的其他形式2、真核生物染色体端粒真核生物染色体端粒DNA结构结构3 、DNA的超螺旋结构的超螺旋结构(三级结构三级结构)知识点 3二级结构的其他形式二级结构的其他形式 1 单链核酸形成的二级结构单链核酸形成的二级结构 2 反向重复与二级结构反向重复与二级结构 3 三螺旋三螺旋DNA 4 DNA的四链结构的四链结构1 单链核酸形成的二级结构单链核酸形成的二级结构 单链核酸的某段碱基可以与另一独立的

22、单链分子单链核酸的某段碱基可以与另一独立的单链分子的碱基配对，形成双螺旋，可以是的碱基配对，形成双螺旋，可以是DNA-DNA、RNA-RNA，也有，也有DNA-RNA分子杂交。分子杂交。发夹结构发夹结构： 同一个单链同一个单链RNA/DNA的一段碱基序列附近的一段碱基序列附近存在着和它互补的碱基序列时，这个单链存在着和它互补的碱基序列时，这个单链自身回折产生一个反平行的双螺旋结构。自身回折产生一个反平行的双螺旋结构。单链单链RNA形成发夹结构形成发夹结构 发夹结构由碱基配对的双螺旋区发夹结构由碱基配对的双螺旋区茎茎和末端不配对的和末端不配对的环环构成。构成。互补序列间间隔较短或无间隔互补序列间

23、间隔较短或无间隔互补序列间间隔较长互补序列间间隔较长2 反向重复与二级结构反向重复与二级结构 反向重复反向重复 ：双链：双链DNA中的一段序列按中的一段序列按确定确定的方向，的方向，读双链中的每条链的读双链中的每条链的序列都相同序列都相同， 反向重复中的序列又称回文序列。反向重复中的序列又称回文序列。单链形成发夹结构单链形成发夹结构v形成十字结构要更耗能，所以在体外反向形成十字结构要更耗能，所以在体外反向重复结构存在多，而体内无该结构。重复结构存在多，而体内无该结构。反反向向重重复复与与十十字字结结构构 作用：作用： 1）较短的回文序列可能是作为一种信号）较短的回文序列可能是作为一种信号 如：

24、限制性内切酶的识别位点如：限制性内切酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点一些调控蛋白的识别位点 例如限制性内切酶例如限制性内切酶 EcoR的识别位点的识别位点 5GAATTC3 3CTTAAG52）转录作用的终止与回文结构也有关系。 v 1953 年年 Watson & Crick 双螺旋双螺旋 DNA构型构型 证明沿大沟存在多余的氢键作为给体与受体证明沿大沟存在多余的氢键作为给体与受体潜在的专一与潜在的专一与DNA (蛋白质蛋白质) 结合的能力结合的能力形成三链形成三链 DNA 可能性可能性 3 三螺旋DNA 1957年年 Felsenfield 发现：当双螺旋发现：当双螺旋DNA中

25、中的一条链为全嘌呤链，另外一条链为全嘧啶的一条链为全嘌呤链，另外一条链为全嘧啶链时，会出现核酸三链结构。链时，会出现核酸三链结构。 poly(U) + poly(U) + poly(A) 三螺旋三螺旋RNA 双螺旋双螺旋 DNA的概念的概念 三链三链DNA是由三条核苷酸链按一定的规律是由三条核苷酸链按一定的规律绕成的螺旋状结构。绕成的螺旋状结构。结构单元：三碱基体，结构单元：三碱基体，结合方式：碱基间形成氢键；结合方式：碱基间形成氢键；三螺旋三螺旋双螺旋基本类型：基本类型： 嘧啶嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶型（嘧啶型（YR*Y）：）：第三条嘧啶链以平第三条嘧啶链以平行于双螺旋中嘌呤链的方向，缠绕到双螺

26、旋的大行于双螺旋中嘌呤链的方向，缠绕到双螺旋的大沟上，与嘌呤链结合。沟上，与嘌呤链结合。 如如TA*T和和CG*C； 其中其中C必须质子化才能稳定三螺旋的结构，其碱基必须质子化才能稳定三螺旋的结构，其碱基氢键构造是霍氏（氢键构造是霍氏（K.Hoogsteen）首先提出，称）首先提出，称为为Hoogsteen霍氏氢键霍氏氢键。 嘌呤嘌呤-嘌呤嘌呤-嘧啶（嘧啶（ YR*R）：）：第三条嘌呤链反平行第三条嘌呤链反平行于双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，于双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，与嘌呤链结合；与嘌呤链结合； 如如CG*G、TA*A、TA*T、CG*A四种。四种。三链三链 DNA可

27、能的功能可能的功能 可阻止调节蛋白与可阻止调节蛋白与 DNA结合结合, 关闭基因转录过程关闭基因转录过程 b) 与基因重组与基因重组, 交换有关交换有关 加入第三条加入第三条DNA 作为分子剪刀作为分子剪刀, 定点切割定点切割DNA分子分子 d) 加入反义的第三条链终止基因的表达加入反义的第三条链终止基因的表达 DNA3-末端较长的末端较长的富含富含G序列序列能够形成回能够形成回折结构（下图折结构（下图a和和b），通过碱基间的非标准配），通过碱基间的非标准配对形成对形成G的四链的四链DNA（下图（下图c和和d）。）。在这样的结构中，在这样的结构中，G形成一种四联体，相互间形成一种四联体，相互间

28、通过通过方式结合。方式结合。GGGG四联体四联体p 结构单元：结构单元：鸟嘌呤四联体鸟嘌呤四联体GGGG类型类型:53TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTGGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色体端粒真核生物染色体端粒DNA结构结构可能的功能可能的功能 A 稳定真核生物染色体结构，稳定真核生物染色体结构，抑制端粒酶的活抑制端粒酶的活性；性；B 保证保证DNA末端准确复制末端准确复制 C 与与DNA分子的组装有关分子的组装有关 D 与染色体的减数分裂和有丝分裂有关与染色体的减数分裂和有丝分裂有关DNA的超螺旋结构的超螺旋结构(三级结构三级结构) 1 超螺旋超螺旋因

29、此因此 超螺旋结构是超螺旋结构是DNA三级结构的主要形式。三级结构的主要形式。 超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。旋两种。真核生物染色体真核生物染色体 线形分子线形分子DNA 组蛋白组蛋白多级螺旋多级螺旋多个类似环型的多个类似环型的 结构结构超螺旋的成因共价封闭环状共价封闭环状DNA或者与蛋白质结合的或者与蛋白质结合的DNA中，双链不能自由转动，额外的张力中，双链不能自由转动，额外的张力不能释放，导致不能释放，导致DNA扭曲来缓解张力，最扭曲来缓解张力，最终形成终形成超螺旋超螺旋。 超螺旋结构的方向性超螺旋结构的方向性DNA分子无论是闭合还是开放结构，只要分子无论是闭合还是开放结构，只要缺乏超螺旋结构，称为缺乏超螺旋结构，称为松旋结构松旋结构。负超螺旋负超螺旋：形