第六章农药残留量的检验

1、第六章 农药残留量的检验农药残留检测技术农药残留检测技术 目的要求 通过本章的学习，目的是使学生掌握农药残留的定义、分类、来源；农药残留毒性；农药残留分析的目的；农药残留的各种分析方法等相关知识。 学习要点一般掌握：农药残留的来源；农药残留的定义、分类；农药残留的毒性等重点掌握：农药残留前处理及分析检测方法。一、农药和农药残留1、农药广义：农业上使用的化学品狭义：主要是指用于预防、消灭或控制危害农、林、牧、渔业生产的有害生物（害虫、害螨、线虫、病原菌、杂草及鼠害等）和有目的地调节植物、昆虫生长的化学药品及生物药品。 第一节概第一节概 论论 2、农药残留、农药残留 指农药使用后残存在生物体、食品

2、（农副指农药使用后残存在生物体、食品（农副产品）和环境中的微量农药原体、有毒代产品）和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。谢物、降解物和杂质的总称。 3、农药残留限量、农药残留限量 世界卫生组织和联合国粮农组织（世界卫生组织和联合国粮农组织（WHO/FAO）定义为：按照良好的农业生产规范，直接或间定义为：按照良好的农业生产规范，直接或间接使用农药后，在食品和饲料中形成的农药残接使用农药后，在食品和饲料中形成的农药残留物的最大浓度。留物的最大浓度。 （表示为（表示为mg/kg或或g/kg） 在世界贸易一体化的今天，农药最高残留限量在世界贸易一体化的今天，农药最高残留限量也成为各

3、贸易国之间重要的技术壁垒。也成为各贸易国之间重要的技术壁垒。 最大残留限量最大残留限量是按各地居民膳食习惯，每日食用是按各地居民膳食习惯，每日食用食品的种类和数量计算的，其量不超过该农药的日食品的种类和数量计算的，其量不超过该农药的日许量。许量。 计算公式：计算公式：MRL=ADI平均体重平均体重(kg)(人的每人的每日食物总量日食物总量(kg) 食物系数食物系数(%) 每日允许摄入量每日允许摄入量(acceptable daily intake,ADI)是指人或动物每日摄入某种化学物质（食品添加剂、指人或动物每日摄入某种化学物质（食品添加剂、农药等），对健康无任何已知不良效应的剂量。农药等）

4、，对健康无任何已知不良效应的剂量。 以相当人或动物公斤体重的毫克数表示以相当人或动物公斤体重的毫克数表示,单位一般是单位一般是mg/Kg,或个或个g/Kg。 例如某化学物质对人体的例如某化学物质对人体的ADI值为值为5mg/Kg，按体重，按体重50Kg计算，则每日摄入该化学物质在计算，则每日摄入该化学物质在250mg以内是安以内是安全的。全的。 ADI值越高，说明该化学物质的毒性越低。值越高，说明该化学物质的毒性越低。 ：为不得检出：为不得检出 ：为不得检出：为不得检出 二、农药的分类二、农药的分类 1、按农药的来源分类：、按农药的来源分类： 可分为矿物源农药、生物源农药与有机合成农药 矿物源

5、农药：有的是无机矿物原料经加工，有的是用矿物油加工成乳剂。ex：砷制剂、氟制剂、铜制剂与硫制剂 生物源农药：主要有植物源农药和微生物源农药。除虫菊素、阿维菌素、苏云金杆菌 有机合成农药：占农药品种的绝大部分，它们是通过化学工业，用有机合成工艺生产出来的。 2、按防治对象分类 杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂、杀线虫剂、除草剂、杀鼠剂、杀软体动物剂、植物生长调节剂等。 3、按化学成分分类 可分为有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、 拟除虫菊酯类等。 常见有机氯类农药：666、DDT、狄氏剂、艾氏剂、毒杀芬、氯丹、七氯、五氯酚钠等 具有高度的物理、化学、生物学稳定性，在具有高度的物理、化学、生物学稳定性，在自然界

6、不易分解，高残留。脂溶性强。自然界不易分解，高残留。脂溶性强。 常见有机磷农药：对硫磷（1605.）、内吸磷（1509）、甲拌磷（3911）、马拉硫磷（4049）、乐果、敌百虫、敌敌畏（DDVP）、杀螟松 属于磷酸酯或硫代磷酸酯类化合物。大多为属于磷酸酯或硫代磷酸酯类化合物。大多为无色或黄色的油状液体，部分为低熔点的固无色或黄色的油状液体，部分为低熔点的固体如敌百虫、乐果等。可溶于有机溶剂，性体如敌百虫、乐果等。可溶于有机溶剂，性质不稳定，易光解、碱解和水解。质不稳定，易光解、碱解和水解。氨基甲酸酯类：分为五大类：萘基氨基甲酸酯类，如分为五大类：萘基氨基甲酸酯类，如西维因；苯基氨基甲酸酯类，如

7、叶蝉散；氨基甲酸肟西维因；苯基氨基甲酸酯类，如叶蝉散；氨基甲酸肟酯类，如涕灭威；杂环甲基氨基甲酸酯类，如呋喃丹；酯类，如涕灭威；杂环甲基氨基甲酸酯类，如呋喃丹；杂环二甲基氨基甲酸酯类，如异索威。杂环二甲基氨基甲酸酯类，如异索威。 除少数品种如呋喃丹等毒性较高外，大多数属中、低毒除少数品种如呋喃丹等毒性较高外，大多数属中、低毒性。性。 拟除虫菊酯类： 一类仿生合成的杀虫剂，是改变天然除虫菊酯的化学结一类仿生合成的杀虫剂，是改变天然除虫菊酯的化学结构衍生的合成酯类。构衍生的合成酯类。 多达多达19种，氰戊菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。种，氰戊菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。 拟除虫菊酯是一类能防治多种害

8、虫的广谱杀虫剂，其杀拟除虫菊酯是一类能防治多种害虫的广谱杀虫剂，其杀虫毒力比老一代杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯虫毒力比老一代杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类提高类提高10100倍。倍。 4、按作用方式分类 1、杀虫剂、杀虫剂 胃毒剂胃毒剂 触杀剂触杀剂 熏蒸剂熏蒸剂 内吸剂内吸剂 2、杀菌剂、杀菌剂 保护作用保护作用 治疗剂治疗剂 铲除剂铲除剂 3、除草剂、除草剂 触杀性除草剂触杀性除草剂 内吸性除草剂内吸性除草剂 三、农药残留的来源三、农药残留的来源 直接污染直接污染 间接污染间接污染 由食物链和生物富集作用造成污染由食物链和生物富集作用造成污染 意外事故造成的食品污染意外事故造成

9、的食品污染 2008年年2月月9日，第二届名古屋中国春节祭在当地的久日，第二届名古屋中国春节祭在当地的久屋大通公园隆重开幕，专程从东京赶来的的中国驻日屋大通公园隆重开幕，专程从东京赶来的的中国驻日大使崔天凯在春节祭上品尝了展台上大使崔天凯在春节祭上品尝了展台上“老三饺子老三饺子”。四、农药残留的危害四、农药残留的危害 农药残留对健康的影响 对神经的影响； 致癌作用； 对肝脏的影响； 诱发突变； 慢性中毒。 药害影响农业生产 农药残留影响进出口贸易 农药残留污染环境、破坏生态 五、农药残留样品的采集五、农药残留样品的采集1、样品的种类、样品的种类 主观样品主观样品 为研究研究农药残留量与各种因素

10、的关系，从设计的实验区域内采集的样品。 客观样品客观样品 监测监测样品和执法样品，测定的农药残留种类是未知的或施药背景不清楚的样品。1 1、实验室样品、实验室样品 从群体采集的送到残留分析实验室的样品。2 2、检测样品、检测样品 实验室经过缩分减量或经过精制后的样品。3 3、检测样份、检测样份 从检测样品中称取的用于分析的样品。4 4、检测溶液、检测溶液 经过提取、净化后进入待测状态。2、取样方法、取样方法 监测调查取样：随机、概率、分布水平 执法取样：强制性、超标与否3、商品取样量要求、商品取样量要求 小的或轻的产品 1.01.5Kg 中等大小产品 2.02.5Kg 大的产品 4.05.0K

11、g 肉、禽、鱼 1.01.5Kg 谷物和制品 0.51.0Kg4、不同样品的采集要求、不同样品的采集要求 根茎类蔬菜根茎类蔬菜 采集整个果实采集整个果实 叶类蔬菜叶类蔬菜 除去腐烂和枯萎部分除去腐烂和枯萎部分 豆类豆类 整个果实整个果实 果类蔬菜果类蔬菜 去除茎部去除茎部 谷物谷物 整个籽粒整个籽粒 肉类肉类 整体整体 5、样品的包装、记录和贮存、样品的包装、记录和贮存标签（2个）编号：样品名称：采样时间：地点：要求：要求： 温度 湿度 光照 单独存放6、样品的预处理、样品的预处理 粉状物粉状物 谷物谷物 小体积水果和蔬菜小体积水果和蔬菜 大体积水果和蔬菜大体积水果和蔬菜 液体样品液体样品 土

12、壤土壤 对含水量较高的样品预处理方法对含水量较高的样品预处理方法 肉：放入铰肉机中铰匀 水果蔬菜等，放入高速组织捣碎器搅匀 蛋类食品，去壳后用打蛋器打匀。 对于包装食品，取出各种调味品后，再制备均匀。第二节第二节 样品前处理技术样品前处理技术 样品前处理：采样技术和样品制备技样品制备技术术。样品处理的原则：样品处理的原则：制备过程中避免组分发生化学变化；要防止和避免欲测定组分的沾污；尽可能减少无关化合物引入制备过程； 尽可能简单易行。 利用残留农药与样品基质的物理化学差物理化学差异异，使其从检测系统有干扰作用的样品基质中提取分离出来（相似相溶）。 极性极性-溶解度、分配系数；挥发性挥发性-蒸汽

13、压。1 1、极性、极性 提取、净化条件的依据。相似相溶原理相似相溶原理：使用与农药极性相近的溶剂为提取剂，使残留农药在溶剂中达到最大溶解度。使残留农药在溶剂中达到最大溶解度。极性判断：电负性、双键、对称性表示：氧化铝吸附剂上洗脱供试溶质的能力2 2、水溶性、水溶性 农药的极性决定其在溶剂中的溶解性。影响溶解性的其他因素影响溶解性的其他因素 温度：高溶解性高 含盐量：盐会降低有机物的溶解度。 pH：影响可解离的农药的溶解度分配定律：分配定律：在一对互不相溶的两相溶剂系统中，由于物质在非极性相和极性相非极性相和极性相中的溶解度不同，当达到平衡时，物质在该两相中的浓度比在一定条件下为常数的定律。K

14、KD D （分配系数） = A= A非极性相非极性相 / B/ B极性相极性相 挥发性：挥发性：液态或固态物质转变为气态的物理性能。挥发性决定：物质在气-液或气-固两相中的分布。分为沸点和蒸汽压。蒸汽压：固态、液态气态提取提取: :是指通过溶解、吸附（吸着）或挥发等方式将样品中的残留农药分离出来的操作步骤，也叫萃取萃取。避免：强酸、强碱、高温、剧烈操作极性-溶解度、分配系数；挥发性-蒸汽压。溶剂萃取溶剂萃取蒸馏技术蒸馏技术固相萃取固相萃取微波萃取微波萃取衍生化衍生化超临界萃取超临界萃取溶剂萃取：溶剂萃取：溶解性差异，选用对残留农药溶解度大的溶剂，将分析物从样品基质中提取出来的方法。关键：关键：

15、选择合适的提取溶剂。液液- -液萃取液萃取液液- -固萃取固萃取液液- -气萃取（溶液吸收）气萃取（溶液吸收）萃取对象萃取对象 两种不相容两种不相容的液体的液体水溶剂：亲水化合物进入水溶剂：亲水化合物进入到水相中。到水相中。有机溶剂：疏水性化合物将进有机溶剂：疏水性化合物将进入有机相中的程度就越大。入有机相中的程度就越大。利用样品中不同组分分配在两种不混溶的溶剂中溶解度溶解度或分配比分配比的不同来达到分离、提取或纯化的目的。有机相有机相水相水相K KD D = c = co oc caqaq有机物质在有机溶剂中的溶解度一般比有机物质在有机溶剂中的溶解度一般比在水相中的溶解度大，分配系数越大，水

16、在水相中的溶解度大，分配系数越大，水相中的有机物可被萃取。相中的有机物可被萃取。 nB0n)VKVKV(mm式中：m m0 0是被萃取溶液中溶质（X）的总含量， m mn n是经过n次萃取后，X在溶剂中的剩余量， V V是被萃取溶液的体积， V VB B是每次萃取所用溶剂B的体积（均为VB）， n n是等量萃取的次数。溶剂体积为样品溶液的溶剂体积为样品溶液的30303535。振荡几次振荡几次打开活塞打开活塞Gas蒸气逸出（也叫放气）蒸气逸出（也叫放气）絮状物絮状物（乳化）（乳化）有机相有机相水相水相水相和絮状物水相和絮状物静置分层静置分层激烈振摇激烈振摇1 12 2 minmin有机相有机相3

17、5次次由于液-液萃取过程中剧烈振动，经常发生乳乳化现象化现象，特别是那些含脂肪脂肪的样品。原因：原因：体系的性质、离子浓度、有机相粘度、萃取温度、pH等。温度越低，温度越低，有机相粘度越大，离子浓度越高越易产生乳化。通过改变KD;改变溶剂或化学平衡作用的添加剂;缓冲剂调节pH;盐调节离子强度等。 离心法破乳，2000r/min，2min； 无水硫酸钠研磨法破乳； 蒸干法，蒸干后，再用有机溶剂萃取。不适用挥发性物质的萃取。 电解质破乳。加入无机盐，通过提高体系中水相的比重使两相分层； 破乳率与加入电解质的量成正比。 l mol/L的盐酸； 无水乙醇溶解两相液滴； 无水硫酸钠漏斗过滤。 玻璃棒搅动

18、，削弱吸附作用； 静置一定的时间后，可自然分层。因为乳浊液是液体杂质以微小珠滴散布在液体溶剂中的一种分散体系，是热力学不稳定体系。固体萃取溶剂振荡（加热）离心/过滤分离欲萃取组分进入溶剂。 溶解和扩散的过程溶解和扩散的过程 分子扩散：分子扩散：固体样品表面/溶剂接解处影响因素：温度、分子大小和液体介质的黏度。对流扩散：对流扩散：远离固体样品表面处的扩散影响因素：流动液体的速度和状态，液体的黏度、样品表面的性质等。1、萃取剂的选择性（极性） 2、稳定性、毒性3、沸点：4080者为宜 4、萃取剂回收的难易与经济性5、色谱检测器的响应 SPE SPE ：Solid Phase ExtractionS

19、olid Phase Extraction是一种液相色谱分离，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物与干扰化合物分离，达到分离和富集目标化合物的目的。慢慢中等中等快快淋洗液淋洗液反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取 阴离子交换 阳离子交换流动相：极性（水溶液）或中等极性固定相：非极性。分离对象：中等到非极性物质。 分析物中的CH键 + 硅胶表面官能团吸附极性溶液中的有机分析物保留在SPE。用非极性溶剂解吸吸附在固定相中的目标物质。 反相固相萃取原理反相固相萃取原理常用反相固相萃取柱常用反相固相萃取柱LC-18LC-18、LC-8 LC-8 ：标准的单键合硅胶ENVI-18ENVI-18、E

20、NVI-8 ENVI-8 ：聚合键合类填料ENVI-Chrom PENVI-Chrom P：苯乙烯：疏水 ENVI-CarbENVI-Carb：含碳 流动相：非极性、中等极性固定相：极性。分析物质：极性、中等极性、非极性正相固相萃取原理正相固相萃取原理 保留取决于分析物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用。 用比样品本身更极性的溶剂洗脱吸附的分析物质。 极性官能团键合硅胶 LC-CN， LC-NH2， LC-Diol 极性吸附物质 LC-Si， LC-Florisil， ENVI-Florisil， LC-Alumina常用正相固相萃取柱常用正相固相萃取柱流流动动相相C. 离子交

21、换固相萃取离子交换固相萃取适用于带有电荷的化合物（水溶液、有机溶液）。原理：静电吸引，化合物上的带电荷基团与键合硅胶上的带电荷基团之间的吸引。分为：阴离子交换和阳离子交换。LC-SAXLC-SAX、LC-NHLC-NH2 2：脂肪族季铵类盐 + 硅胶LC-SCXLC-SCX：磺酸基；LC-WCXLC-WCX：羧酸基团 目标化合物在极性/非极性溶剂中的溶解度溶解度，这主要涉及淋洗液的选择。 目标化合物有无可能离子化离子化（可用调节pH值实现离子化）。 目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键共价键。 在吸附剂上吸附点的竞争程度竞争程度，关系到能否很好分离。筛板筛板筛板筛板筛板筛板（1）活化吸附剂 萃

22、取之前要用适当的溶剂淋洗小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。（2）上样（吸附） 样品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂。 （3）洗涤（去除杂质）在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉。（4）洗脱和收集 再用较强的溶剂将目标化合物洗脱下来，加以收集。活化吸附剂活化吸附剂进进 样样洗洗 涤涤洗洗 脱脱 不是将待测物质全部分离出来，通过在样品与固相涂层间的平衡来达到分离。方法：玻璃纤维浸入样品中残留农药扩散吸附平衡取出玻璃纤维洗脱分析。关键：关键：石英纤维上涂吸附剂石英纤维上涂吸附剂原则：原则：目标化

23、合物是非极性目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。合物是极性时选择极性涂层。三、超临界流体萃取技术三、超临界流体萃取技术 超临界流体萃取技术是以超临界状态下的流超临界流体萃取技术是以超临界状态下的流体作为溶剂，利用该状态下流体所具有的高体作为溶剂，利用该状态下流体所具有的高渗透能力和高溶解能力萃取分离混合物的过渗透能力和高溶解能力萃取分离混合物的过程。程。 超临界流体物体处于其临界温度和临界压力以上时的状态。气体：粘稠度、表面张力低，溶解能力强，萃取功能高。压力，溶解能力。液体：体积小。流体名称流体名称分子式分子式临界压力临界压力(bar)

24、(bar)临界温度临界温度()()临界密度临界密度(g/cm(g/cm3 3) )二氧化碳二氧化碳COCO2 272.972.931.231.20.4330.433水水H H2 2O O217.6217.6374.2374.20.3320.332氨氨NHNH3 3112.5112.5132.4132.40.2350.235乙烷乙烷C C2 2H H6 648.148.132.232.20.2030.203氧化二氮氧化二氮N N2 2O O71.771.736.536.50.4500.450 在3540下提取 干净的提取方法 CO2是一种不活泼的气体。 循环使用，降低成本。 参数可以调节特特 点

25、点流动相流动相四、微波萃取技术四、微波萃取技术微微 波波金属金属水分水分吸收微波、反射微波、透过微波吸收微波、反射微波、透过微波 频率：300300 000MHz的电磁波。穿透：玻璃、塑料、陶瓷等绝缘体。当微波作用于水和酸性物质时，将被极性分子所吸收，因而物质很快被加热。吸收微波细胞内部温度，细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力细胞破裂有效成分自由流出。微波所产生的电磁场加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率影响因素影响因素 萃取温度的影响 萃取溶剂的影响 样品杯：聚四氟乙烯 微波萃取被誉为微波萃取被誉为“绿色分析化学绿色分析化学”。是。是因为微波萃取试剂用量少，节能、省时，因为微波萃取试剂用

26、量少，节能、省时，污染小。使用更少的溶剂，更快的时间，污染小。使用更少的溶剂，更快的时间，更好的回收率，处理批量大，萃取效率更好的回收率，处理批量大，萃取效率高。高。 能量外部向内部传递。超声波使溶液形成气泡（空化效应）爆裂温度和压力，增强化学反应能力。优点：价廉快速，简便安全，批量处理样品。化学反应定量生成适于分析。 灵敏度与选择性 改善色谱分离： 理化稳定性柱柱前前衍生化：为了分离衍生化：为了分离柱柱后后衍生化：为了检测衍生化：为了检测（1 1）硅烷化衍生化方法）硅烷化衍生化方法（2 2）酯化衍生化方法）酯化衍生化方法（3 3）卤化衍生化方法）卤化衍生化方法（4 4）酚化衍生化方法）酚化衍

27、生化方法方法方法利用醇、酚、酸、胺等与硅烷化试剂反利用醇、酚、酸、胺等与硅烷化试剂反应，形成挥发性的硅烷衍生物应，形成挥发性的硅烷衍生物R R3 3SiSiX + X + H HRRR R3 3SiSiRR + H + HX X大多数有机酸有机酸挥发性、热稳定性差。在GC分析之前衍生为相应的酯。 甲醇法 重氮甲烷法 三氟乙酸配法 甲醇法 有机酸与甲醇在催化剂的存在下加热，可以发生酯化反应，生成有机酸的甲酯RCOOH + RCOOH + CHCH3 3OHOH催化剂催化剂RCOO CHRCOO CH3 3 + H + H2 2 O O与有机酸反应，生成有机酸的甲酯，重氮甲烷不稳定，有爆炸性，有毒

28、。 RCOOH + RCOOH + CHCH2 2N N2 2RCOO CHRCOO CH3 3 + N + N2 2引入卤原子ECD检测器也改善挥发性和稳定性。 卤素的作用是加成加成或取代取代 1. 1. 紫外衍生化反应紫外衍生化反应2 2荧光衍生化反应荧光衍生化反应3 3电化学衍生化反应电化学衍生化反应苯甲酰氯 + 胺、醇、酚苯甲酸酯类衍生物（200-360 ）在目标化合物上接上能发出荧光的生色基团，如荧光素。 农药残留检测是微量或超微量分析，农药残留检测是微量或超微量分析，一般可分为化学检测、生化检测和生一般可分为化学检测、生化检测和生物检测。物检测。 当前使用较多的有仪器分析法、免疫当

29、前使用较多的有仪器分析法、免疫分析法、生物传感器法、活体检测法、分析法、生物传感器法、活体检测法、酶抑制法等。酶抑制法等。 第三节第三节 农药残留检测的常用农药残留检测的常用技术技术 1、仪器分析 凡是沸点大约在 500，分子量在 400以下的农药，原则上都可以用气相色谱法分离和分析，目前 80以上的农药可以用它检测。 我国农药检测现行的国家标准和行业标准多采用气相色谱法。 高效液相色谱法（HPLC） 适合于非挥发性、大分子、强极性和热稳定性差的农药的分离分析。高效液相色谱仪基本装置高效液相色谱仪基本装置流动相流动相进样阀进样阀注入样品液注入样品液色谱柱色谱柱检测器检测器色谱处理机色谱处理机高

30、压泵高压泵流出液流出液 薄层色谱薄层色谱 又叫薄板层析薄板层析是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量、定性的一种层析分离技术。 气相色谱质谱连用 二级串联质谱（GC-MS-MS）的联用 液相色谱质谱的连用 超临界色谱技术 高效毛细管电泳 毛细管区带电泳法 毛细管胶束电动色谱2、免疫分析法 放射免疫法放射免疫法：是利用同位素标记的方法检测。 酶免疫法：酶免疫法： 是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。 荧光免疫法：荧光免疫法： 是利用荧光素标记待测农药进行检测。3、酶抑制法、酶抑制法是将酶加入待测溶液中

31、，根据酶的不同活性，用分光光度计测量吸光值大小，计算农药残留的高低。 4、免疫亲和色谱、免疫亲和色谱其利用抗原抗体反应的专一性，使分离、净化和浓缩同时进行，一步柱色谱就可使复杂样品提取液中的目标组分得到高纯度与富集。5、生物传感器法、生物传感器法 生物传感器通常是指由一种分子识别分子识别元件（生物敏感部件）元件（生物敏感部件）与信号转换器信号转换器紧密配合，对特定种类化合物或生物活性物质具有选择和可逆响应的分析工具。 分子识别元件：酶、抗体、受体、细分子识别元件：酶、抗体、受体、细胞及胞及组织器官等组织器官等 信号转换器：电极、半导体、光导纤信号转换器：电极、半导体、光导纤维、维、压电晶体、表

32、面声波、热敏电压电晶体、表面声波、热敏电阻等阻等生物生物传感传感器器 （1）酶生物传感器：）酶生物传感器： （2）免疫生物传感器：）免疫生物传感器：利用抗体和抗原抗体和抗原之间的免疫化学反应来制作的生物传感器。 （3）微生物传感器）微生物传感器 ：利用活微生物的代谢功代谢功能能检测污染物换能器（Transducer）感受器（Receptor）测量信号（Measurable Signal）=分析物（Analyte）溶液（Solution）选择性膜（Thin selective membrane）识别元件（RECOGNITION）生物传感器工作机理6、流动注射免疫分析法、流动注射免疫分析法 7、活

33、体检测法，、活体检测法，8、细菌发光、细菌发光 细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为及长链脂肪醛氧化为FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为度在波长为450-490nm处的蓝绿光。处的蓝绿光。 缺点：缺点： 细胞发光强度本质差异较大细胞发光强度本质差异较大 检测期间发光自然变化幅度较宽，检测期间发光自然变化幅度较宽，重现性不佳，误差较大等。重现性不佳，误差较大等。 由于农药品种多、化学结构和性质各由于农药品种多、

34、化学结构和性质各异、待测组分复杂，尤其是近年来，异、待测组分复杂，尤其是近年来，高效、低毒、低残留农药品种不断涌高效、低毒、低残留农药品种不断涌现，在农产品和环境中残留量很低，现，在农产品和环境中残留量很低，给农药残留检测技术提出了更高的要给农药残留检测技术提出了更高的要求。求。 农药残留检测技术朝着快速、方便、农药残留检测技术朝着快速、方便、灵敏可靠的方向发展。灵敏可靠的方向发展。 生物技术与现代理化分析手段相结合。生物技术与现代理化分析手段相结合。 第四节第四节 各种农药残留的检测各种农药残留的检测方法方法 由于农药分析目的各不相同，所以必须采用由于农药分析目的各不相同，所以必须采用适合于

35、所要解决问题的具体分析方法。如：适合于所要解决问题的具体分析方法。如：特定活性成分残留检测或同一批次产品中任特定活性成分残留检测或同一批次产品中任一农药的残留水平。一农药的残留水平。 多残留分析方法用来检测和测定系列食品中的多多残留分析方法用来检测和测定系列食品中的多种农药残留，可对多种农药残留量进行评估以确种农药残留，可对多种农药残留量进行评估以确定其是否处于或低于规定的允许残留水平；定其是否处于或低于规定的允许残留水平； 单一残留分析方法是用于测定单一残留物，而且单一残留分析方法是用于测定单一残留物，而且测定的残留物的主要代谢物和转化产物测定的残留物的主要代谢物和转化产物 半定量和定性方法

36、（筛选法）能够估算样品中某半定量和定性方法（筛选法）能够估算样品中某种农药的残留水平。种农药的残留水平。一、食品中有机磷类农残的检测方法一、食品中有机磷类农残的检测方法 有机磷农药是指在组成上含有磷的有机杀虫剂、杀有机磷农药是指在组成上含有磷的有机杀虫剂、杀菌剂等。主要类型有：菌剂等。主要类型有： 磷酸酯型，如久效磷、磷胺等 二硫代磷酸酯型，如马拉硫磷、乐果、甲拌磷、亚胺硫磷 硫酮磷酸酯型，如对硫磷、甲基对硫磷、内吸磷、杀螟松 硫醇磷酸酯型，如氧化乐果、伏地松 磷酰胺型，如甲胺磷、乙酰甲胺磷 膦酸酯型，如敌百虫、苯脯磷 有机磷农药种类很多，按毒性分为高毒（剧有机磷农药种类很多，按毒性分为高毒（

37、剧毒）、中毒、低毒三类；毒）、中毒、低毒三类； 溶解性：多数难溶于水，可溶于有机溶剂溶解性：多数难溶于水，可溶于有机溶剂 水解性：在碱性介质中易水解水解性：在碱性介质中易水解 氧化性：硫代磷酸酯类在溴、紫外线等作用氧化性：硫代磷酸酯类在溴、紫外线等作用下其中的下其中的S可被可被O取代。取代。 酶抑制活性：可抑制羧酸酯酶、胆碱酯酶的酶抑制活性：可抑制羧酸酯酶、胆碱酯酶的活性活性 有机磷农药限量有机磷农药限量标准号标准号农药名称农药名称粮食粮食蔬菜、水果蔬菜、水果食用植物油食用植物油GB5127乐果乐果1.00.1敌敌畏敌敌畏0.2对硫磷对硫磷0.1不得检出不得检出马拉硫磷马拉硫磷3GB4788甲

38、拌磷甲拌磷0.02不得检出不得检出不得检出不得检出杀螟硫磷杀螟硫磷50.5不得检出不得检出倍硫磷倍硫磷0.050.050.01GB14868辛硫磷辛硫磷0.050.05GB14872乙酰甲胺磷乙酰甲胺磷0.2蔬菜蔬菜0.2水果水果0.5 续上表续上表标准号标准号农药名称农药名称粮食粮食蔬菜、水果蔬菜、水果食用植物油食用植物油GB14873甲胺硫甲胺硫0.1GB14874甲基对硫磷甲基对硫磷0.10.1GB14928.1地亚农地亚农0.10.5GB14928.3甲基嘧啶硫磷甲基嘧啶硫磷5GB14928.8水胺硫磷水胺硫磷0.10柑橘柑橘0.02GB14928.10喹硫磷喹硫磷大米大米0.2蔬菜蔬

39、菜0.2水果水果0.5GB14969克线磷克线磷甘蔗甘蔗0.005柑橘柑橘0.005（一）国标测定方法（一）国标测定方法实验步骤实验步骤 1、样品处理 选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取样品1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入5 mL缓冲液，振荡12 min，倒出提取液，静置35 min，待用。 2、对照溶液测试 先于试管中加入2.5 mL缓冲液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL显色剂。摇匀后于37 放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1 mL低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应3 min

40、的吸光度的变化值A0。 3、 样品溶液测定 先于试管中加入2.5 mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应3 min的吸光度的变化值At。 结果计算结果计算 抑制率（%）= 式中 A0对照液反应3 min吸光度的变化值； At样品溶液反应3 min吸光度的变化值。10000AAAt酶抑制率法对部分农药的检出限酶抑制率法对部分农药的检出限 注注 意意 葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的次生物质，容易产生假阳性。处理这类含有对酶有影响的次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面测定

41、法。对一些样品时，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，减含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，减少色素的干扰。少色素的干扰。 当温度条件低于当温度条件低于37度，酶反应的速度随之放慢，加入酶液度，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相应延长，延长时间的确定，和显色剂后放置反应的时间应相应延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试应以胆碱酯酶空白对照测试3min吸光度变化差值在吸光度变化差值在0.3以上，以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置

42、时间一致才有可比性。时间一致才有可比性。 胆碱酯酶空白对照测试胆碱酯酶空白对照测试3min吸光度变化差值在吸光度变化差值在0.3以下的原以下的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。因：一是酶的活性不够，二是温度太低。 （二）免疫分析技术（二）免疫分析技术 酶联免疫分析技术酶联免疫分析技术 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。免疫活性，又保留酶的活性。 在测定时，把

43、受检标本（测定其中的抗体或抗原）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。成一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，物，产物的量与标本中受检物质的量

44、直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。 双抗体夹心法双抗体夹心法 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 双位点一步法双位点一步法 间接法

45、测抗体间接法测抗体 竞争法竞争法 捕获法测捕获法测IgM抗体抗体 应用亲和素和生物素的应用亲和素和生物素的ELISA 对硫磷的酶联免疫分析有机磷农药属于小分子物质，必须与大分子联结，才有机磷农药属于小分子物质，必须与大分子联结，才能作为免疫原。能作为免疫原。 免疫抗原的合成免疫抗原的合成浓盐酸浓盐酸金属还原剂金属还原剂（Zn/Fe）H3-N重氮化重氮化氨基对硫磷对硫磷 亚硝酸钠亚硝酸钠 低温低温1605与牛血清蛋白酪氨酸上羟基的邻位结合 BSABSA免疫抗原免疫抗原（载体蛋白）（载体蛋白） 目前，国外已研制出几十种农药的酶目前，国外已研制出几十种农药的酶免疫检测试剂盒，包括有机磷类、氨免疫检测

46、试剂盒，包括有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类以及酰胺类等。类以及酰胺类等。 有机磷有机磷20ug/kg 氨基甲酸酯类氨基甲酸酯类300ug/kg 它具有专一性强、灵敏度高、快速、它具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，试剂盒可广泛用于操作简单等优点，试剂盒可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测，可现场样品和大量样品的快速检测，可准确定性、定量。准确定性、定量。 但由于受到农药种类多，抗体制备难但由于受到农药种类多，抗体制备难度大度大 （二）生物化学测定法（二）生物化学测定法 酶抑制活性：可抑制羧酸酯酶、胆碱酶抑制活性：可抑制羧酸酯酶、胆碱酯

47、酶的活性。酯酶的活性。 速测卡速测卡速测卡速测卡 （1）原理）原理 胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色）。酸和靛酚（蓝色）。 有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断样品中是否由有机磷或氨基甲酸酯由此可判断样品中是否由有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。类农药的存在。 （2）试剂）试剂 固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡）。测卡）。 pH7.5缓冲溶液：分别取缓

48、冲溶液：分别取15.0g磷酸氢二钠磷酸氢二钠 Na2HPO412H2O与与1.59g无水磷酸二氢钾无水磷酸二氢钾 KH2 PO4 ，用，用500mL蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。 （4）分析步骤）分析步骤 整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，泥土， 1cm左右碎片左右碎片 5g放入带盖瓶中放入带盖瓶中 10mL缓冲溶液缓冲溶液震摇震摇50次次静置静置2min以上以上用白色药片用白色药片沾取提取液沾取提取液放置放置10min 预反应（预反应（37，10min，预反应后的药片表面必须保持湿润）预反应后的药片表面必须保持湿润） 将速测卡对将速测卡对

49、折折 3min 使红色药片与白色药片叠合使红色药片与白色药片叠合反应。反应。 表面测定法（粗筛法）：擦去蔬菜表面泥土表面测定法（粗筛法）：擦去蔬菜表面泥土滴滴23滴缓冲溶液滴缓冲溶液表面表面用另一片蔬菜在滴液处摩用另一片蔬菜在滴液处摩擦擦取速测卡取速测卡将蔬菜上的液滴滴在白色药片上将蔬菜上的液滴滴在白色药片上放置放置10min 将速测卡对折将速测卡对折3min 使红色药片与使红色药片与白色药片叠合反应。白色药片叠合反应。 （5）结果判断）结果判断 以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（为阳性）、未抑制（为阴性）表示。（为阳性）、未抑制（为阴性）表示。 与空白对照

50、卡比较，白色药片不变色或略有浅与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。空白对照卡相同，为阴性结果。 对阳性结果的样品，可用其它分析方法进一步对阳性结果的样品，可用其它分析方法进一步确定具体农药品种和含量。确定具体农药品种和含量。 （6）注意事项）注意事项 韭菜、葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、韭菜、葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的次蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整棵蔬

51、菜萃取或采用表面测定时，可采取整棵蔬菜萃取或采用表面测定法。法。 对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜萃取的方法，减少干扰因素。株蔬菜萃取的方法，减少干扰因素。 部分农药的检出限（速测卡）部分农药的检出限（速测卡）符合率：在检出的符合率：在检出的50份以上阳性样品中，经气份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应该在相色谱法验证，阳性结果的符合率应该在80以上。以上。 生物化学测定法检测时，蔬菜中的水生物化学测定法检测时，蔬菜中的水份、碳水化合物、蛋白质、脂等物质份、碳水化合物、蛋白质、脂等物质不会对农药残留物的检测造成干扰，不会对农药残留

52、物的检测造成干扰，不必进行分离去杂，节省了大量预处不必进行分离去杂，节省了大量预处理时间，从而能达到快速检测的目的。理时间，从而能达到快速检测的目的。 因此该方法具有快速方便、前处理简因此该方法具有快速方便、前处理简单、无需仪器或仪器相对简单，适用单、无需仪器或仪器相对简单，适用于现场的定性和半定量测定。于现场的定性和半定量测定。 （三）化学方法（三）化学方法 1、气相色谱、气相色谱 2、有机磷农药速测灵法（金属离子催、有机磷农药速测灵法（金属离子催化显色表面皿法）化显色表面皿法） 1、气谱方法、气谱方法 是目前比较权威的方法，可以精确定是目前比较权威的方法，可以精确定量，可测出多种不同种类农

53、药。但检量，可测出多种不同种类农药。但检测成本高，仪器操作须专业人员，前测成本高，仪器操作须专业人员，前处理要求较高，时间长。处理要求较高，时间长。 按照国家标准方法按照国家标准方法GB5009.20-2003 2、有机磷农药速测灵法、有机磷农药速测灵法原理原理 具有强催化作用的金属离子催化剂，使各类具有强催化作用的金属离子催化剂，使各类有机磷农药（磷酸酯、二硫代酸酯、磷酸胺）有机磷农药（磷酸酯、二硫代酸酯、磷酸胺）在催化作用下水解为磷酸与醇，水解产物与在催化作用下水解为磷酸与醇，水解产物与显色剂反应，使显色剂的变色。显色剂反应，使显色剂的变色。 检测方法：检测方法： 显色液显色液2滴滴 取农

54、药溶液取农药溶液34mL测试皿测试皿混匀混匀静置静置 催化液催化液 510min 观察变化。观察变化。 主要针对的是有机磷农药的残留检测，特别主要针对的是有机磷农药的残留检测，特别是甲胺磷、对硫磷农药。是甲胺磷、对硫磷农药。 这种方法采用化学反应原理，避免了通常所这种方法采用化学反应原理，避免了通常所使用生化方法（酶法）的缺点（酶的制备、使用生化方法（酶法）的缺点（酶的制备、保存以及反应需比较严格的条件），灵敏度保存以及反应需比较严格的条件），灵敏度也达到一定的要求也达到一定的要求 二、氨基甲酸酯类农药的检测二、氨基甲酸酯类农药的检测 氨基甲酸酯类农药也是一种抑制胆碱酯氨基甲酸酯类农药也是一种抑制胆碱酯酶的神经毒物，但氨基甲酸酯类和胆碱酶的神经毒物，但氨基甲酸酯类和胆碱酯酶作用不形成氨基甲酰酯。酯酶作用不形成氨基甲酰酯。 它是一种可逆性抑制剂，水解后可复原它是一种可逆性抑制剂，水解后可复原成酯酶和氨基甲酸酯，因此它的中毒症成酯酶和氨基甲酸酯，因此它的中毒症状消失快，并且没有迟发性神经毒性。状消失快，并且没有迟发性神经毒性。 氨基甲酸酯类杀虫剂进入人体内，氨基甲酸酯类杀虫剂进入人体内，在胃中酸性条件下可在胃中酸性条件下可与食物中的亚硝基化合物的前体物质亚硝酸盐和硝