第九章生物芯片及数据分析技术

1、第九章第九章生物芯片及数据生物芯片及数据分析技术分析技术在20世纪科技史时有两件事是值得大书特书的： （1）微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入到每个家庭； （2）DNA芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。 美国美国财富财富杂志杂志人类基因组计划人类基因组计划（human genome project, HGP）是一项国际性科学研究计划，旨在阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，从物理和功能角度发现和定位人类基因组基因，破译人类全遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。对人类基因组的研究推动了整个

2、生命科学的发展，同时也形成一门崭新的科学基因组学（genomics），即研究基因组的科学。 上世纪70年代，美国投入巨资的搁浅，人们渐渐认识到，包括癌症在内的各种人类疾病都与基因直接或间接相关 1984年，美国能源部（DOE）首次探讨人类基因组DNA进行全序列分析的前景 1986年美国生物学家、诺贝尔奖获得者杜尔贝科(R. Dulbecco) 在science发表癌症研究的转折点测定人类基因组序列（ ）得到热烈响应。 1990年10月1日，人类基因组计划正式启动。 2001年2月，人类基因组序列“工作框架图”公布 2006年5月，最后一条染色体序列被公布 2008年1月，个人基因组计划启动 以

3、具有遗传多态性的遗传以具有遗传多态性的遗传标记为位标、以遗传学距离为标记为位标、以遗传学距离为图距的基因组图。图距的基因组图。 遗传学距离以厘摩遗传学距离以厘摩（centi-Morgan, cM）表示。）表示。连锁的遗传标志之间的重组频连锁的遗传标志之间的重组频率为率为1% 时，它们的相对距离时，它们的相对距离为为1cM， 相当于相当于106 bp(1Mb)。 遗传多态性标记为：遗传多态性标记为：RFLP、MS/STR、SNP。 以一段已知核苷酸序以一段已知核苷酸序列的列的DNA片段片段（称为序列（称为序列标签位点，标签位点，sequence tagged site，STS）为位标，）为位标，

4、对构对构成基因组的成基因组的DNA分子进行分子进行测定，从而对某段测定，从而对某段DNA序序列在染色体上的相对位置列在染色体上的相对位置做一线性排列。做一线性排列。 以以kb或或Mb作为图距而作为图距而绘制的基因组图。绘制的基因组图。核苷酸序列图即最详尽的物理图。通过测序得到基因组的序列，是一般意义上的人类基因组计划。GeneBank数据的快速增长人类基因组计划催生了大量生物数据怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成了全世界生命科学工作者共同的课题！传统核酸印迹杂交的局限性传统核酸印迹杂交的局限性 传统核酸印迹杂交：Southern Blotting 和Norther

5、n Blotting等 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等对核酸序列分析与测定提出的新要求 速度快、效率高 高通量（可同时对大量核酸序列进行检测和分析） 操作简便、自动化程度更高 成本低 生物芯片技术生物芯片技术正是在这样的背景下应运正是在这样的背景下应运而生。而生。生物芯片技术生物芯片技术 定义：定义：是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子、糖类甚至组织切片和细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、滤膜等载体）的表面，组成高度密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样本中的靶分子杂交，通过特定的仪

6、器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 原理：原理：分子间特异性相互作用 核酸杂交 抗原抗体作用 DNA蛋白质间的识别作用等特点：特点：高通量高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子） 微型化微型化（可装入口袋） 自动化自动化（技术自动化；结果分析自动化） 低成本低成本（相对于同时进行大量分子研究而言） 防污染防污染分类：分类：生物芯片DNA芯片（基因芯片）蛋白质芯片组织芯片细胞芯片微阵列芯片芯片实验室（Lab-on-a-chip）：生物芯生物芯片技术发展的最终目标。片技术发展的最终目标。把生物、化学等领域中所涉及的样品制备、生物化学反应、分离检测等基本操

7、作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。 生物芯片技术流程生物芯片技术流程 第一节 DNA芯片（DNA chip） 又称为基因芯片（Gene chip）或 DNA微阵列（DNA Microarray）。 将大量已知的探针（寡核苷酸片段或DNA片段）固定于支持物上，然后与标记的样品DNA按碱基互补配对原则进行杂交（探针能够在基因混合物中识别出特定基因），最后通过检测杂交信号的强度及分布来对特定基因进行分析。 基本环节：基本环节： 芯片制作芯片制作 样品制备样品制备 分子杂交分子杂交 检测分析检测分析 DNA芯片制作芯片制作 就

8、是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针通过一定的方法固定到固相支持物上。 主要有两种：原位合成法和直接点样法原位合成法和直接点样法的比较1.1.支持物：如玻片、硅片、支持物：如玻片、硅片、NCNC膜、膜、NylonNylon膜膜2.2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的在支持物上，每个位点的序列是已知的外观外观探针探针支持物支持物剖面图剖面图平面局部放大平面局部放大 样品制备（样品制备（DNA、mRNA） 与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。 生物素 常用

9、标记物： 荧光素待测样品（用Cy3-dUTP 标记） 对照样品（Cy5-dUTP） 以表达谱芯片为例：以表达谱芯片为例： 提取样本组织细胞中的提取样本组织细胞中的mRNA（样本要新鲜并有代表性）（样本要新鲜并有代表性） 对提取的对提取的mRNA进行纯化进行纯化 逆转录合成逆转录合成cDNA（可进行（可进行PCR以提高灵敏度）以提高灵敏度） 以双链以双链cDNA为模板进行体外转录（荧光标记在此渗入）为模板进行体外转录（荧光标记在此渗入） 分子杂交分子杂交是已标记的样品与芯片上的探针进行反应后产生一系列信息的过程。 与传统的核酸分子杂交相同，但要求更高：u 选择合适的反应条件、减少生物分子之间的错

10、配率。 u 考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。 利用生物素标记的，在此染色（常用抗生蛋白链菌素-藻蓝蛋白 ） 检测分析检测分析利用专门的芯片扫描仪对杂交结果进行图象采集和分析。 荧光标记阳性杂交图基因芯片检测结果基因芯片检测结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红黄绿兰紫的核酸分子数的差异。红黄绿兰紫DNADNA测序测序：杂交测序（：杂交测序（SBHSBH）疾病诊断疾病诊断：寻找和检测与疾病相关的基因：寻找和检测与疾病相关的基因及在及在RNARNA水

11、平上检测致病基因的表达水平上检测致病基因的表达用药个体化分析：用药个体化分析：药物筛选：药物筛选：基因表达研究：基因表达研究：1 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTTAGATCDNA 样 品 TATGCAATCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1 ATACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 GTTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：

12、TATGCAATCTAG利用利用DNADNA芯片进行杂交测序的原理芯片进行杂交测序的原理 杂交测序技术（杂交测序技术（SBHSBH）可大规模地检测和分可大规模地检测和分析析DNADNA的变异及多态性。的变异及多态性。突变突变疾病诊断疾病诊断1 1、用于诊断遗传性疾病、用于诊断遗传性疾病 例：上海联合基因公司开发了-地中海性贫血的检测芯片2 2、用于病原体的检出和确定、用于病原体的检出和确定 例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。 3 3、肿瘤的基因诊断、肿瘤的基因诊断 例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P

13、53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。药物筛选药物筛选利用利用DNADNA芯片技术可比较正常组织（细芯片技术可比较正常组织（细胞）与病变组织（细胞）中大量相关基胞）与病变组织（细胞）中大量相关基因表达的变化，从而发现一组疾病相关因表达的变化，从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。应用基因作为药物筛选靶标。应用DNADNA芯片芯片还可直接筛选特定的基因文库以寻找药还可直接筛选特定的基因文库以寻找药物作用的靶点。物作用的靶点。表达谱芯片是DNA芯片中最常用的一种芯片。Affymetrix基因表达谱芯片的实验流程 生物信息学分析生物信息学分析基因芯片读数实际上是扫描后的信号强度，是一种相对值

14、。不同芯片之间要经过以看家基因作为对照的标准化处理才有可比性。常用GAPDH或-actin基因归一化的数据归一化的数据1、差异基因的筛选、差异基因的筛选倍数差异FoldChange=SignalA/SignalB（即待比较的两个标准化以后的信号相除所得的值） 常用标准Ratio（0.5，2.0）显著性差异p值：进行统计学t检验，p0.05为显著性差异，p0.01为强显著性差异 生物学重复不少于3个每个探针点的Flag值/Call值：表达谱芯片中常用A、P、M来表示该探针点信号与背景信号的差异 A-Absent：无显著性差异 P-Present：有显著性差异 M-Marginal：差异介于A和P

15、之间 要求比较的两组，至少有一组内不出现A火山图（Volcano plot）散点图（Scatter plot）视图分析视图分析 聚类分析聚类分析将基因与最相关的表达谱放在一起，分析的基础是总基因组的线性相关。生物系统的有序性质可以保证聚类分析方法会揭示出生物行为的有趣特征。 GO（GeneOntology）分析）分析 寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功能的改变有关。 分类： 分子功能（Molecular Function） 生物过程（biological process） 细胞组成（cellular component）常用数据库： DAVID、GATHER、PANTHER等 表 健脾益气

16、法相关差异基因GO分类（DAVID 6.7）KEGGpathway分析分析 常用数据库： DAVID、BIORAG（Bio Resource for Array Genes）等 包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，及同系保守的子通路等信息 深入分析：涉及Gq蛋白激活的花生四烯酸-HETEs代谢通路表 健脾益气法相关差异基因信号通路分析（DAVID 6.7）蛋白分子相互作用分析蛋白分子相互作用分析 常用数据库： STRING 、pSTIING等String9.05在线分析 pSTIING在线分析 单基因分析单基因分析 常用数据库： 美国国家生物技术信息中心（NCBI） 欧洲

17、生物信息研究所（EBI）蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术 蛋白质芯片（Prochip） 与DNA芯片比较类似，只不过蛋白质芯片利用的是抗原/抗体、配基/配体（或受体）等蛋白质之间的相互作用。蛋白质芯片蛋白质芯片与DNA芯片的差异： 检测方法基本相同 应用方向不同 制备时的配基不同、固定条件不同 点样密度不同 结合反应的原理不同 根据研究目的不同，蛋白芯片的探针可选根据研究目的不同，蛋白芯片的探针可选用某些特定的抗原、抗体、酶和受体等。用某些特定的抗原、抗体、酶和受体等。 探针的标记主要有：探针的标记主要有： 酶标记（如辣根过氧化物酶酶标记（如辣根过氧化物酶HRPHRP、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶APA

18、P） 荧光标记（常用荧光标记（常用Cy3Cy3和和Cy5Cy5） 化学发光物质标记（如吖啶酯）等化学发光物质标记（如吖啶酯）等蛋白质芯片探针及其标记蛋白质芯片探针及其标记 分子间的反应分子间的反应 主要有：主要有： 抗原抗体反应抗原抗体反应 蛋白质分子与其它蛋白分子或与核酸分子之蛋白质分子与其它蛋白分子或与核酸分子之 间的特异性识别结合间的特异性识别结合 酶与底物的识别等酶与底物的识别等 通过优化合适的反应条件使生物分子间反应处通过优化合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，可以减少生物分子之间的错配于最佳状况中，可以减少生物分子之间的错配比率。比率。 蛋白质芯片信号的检测蛋白质芯片信号的检测 对吸附到蛋白质芯片表面靶蛋白的检测主要有两对吸附到蛋白质芯片表面靶蛋白的检测主要有两种方式种方式 ：1 1、以质谱技术为基础的、以质谱技术为基础的直接检测法直接检测法如表面增强激如表面增强激光解析离子化光解析离子化- -飞行时间质谱技术飞行时间质谱技术(SELDI - TOF - (SELDI - TOF - MS)MS)2 2、蛋白质标记法蛋白质标记法：荧光标记的芯片既可用激光共聚焦检测，也可用荧光标记的芯片既可用激光共聚焦检测，也可用电荷偶联照像系统（电荷偶联照像系统（CCDCCD）进行检测）进行检测酶标芯片显色后用高