超剂量造血干细胞移植诱导免疫耐受的研究

1、    超剂量造血干细胞移植诱导免疫耐受的研究        为了降低严重移植物抗宿主病（GVHD）的发生及易于造血干细胞的植入，异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）多数在HLA相合的供受者间进行，有些患者则往往在等待合适供者的过程中因疾病进展或复发而死亡。基本上每例患者都有一个HLA单倍型半相合的亲属（父母、子女、同胞）可以作为供者。因此，人们试对那些没有合适供者的患者实行HLA半相合的亲属移植。但是，进行HLA半相合的异体全骨髓移植，最大障碍就是严重的GVHD或移植

2、物排斥。清除T细胞后的移植，在患严重的联合免疫缺陷病儿童中成功地预防了GVHD的发生，但对白血病的治疗效果却令人失望，虽然克服了GVHD，但移植物排斥率却大大增高。Reisner等1的研究发现有2种方法可以克服异体移植时的HLA屏障：一是增加移植的造血干细胞(HSC)数量；二是利用异体不反应T细胞（nonalloreactive T cells）辅助移植。现就“超剂量”HSC移植(HSCT)诱导对供者特异性的耐受方面的研究作一简要综述。1“超剂量”HSCT在临床应用中的探索很早以前的研究就发现提高骨髓移植物中细胞数可克服异体移植时的遗传学屏障，但实现异体移植却需要比自体移植多十倍的接种细胞量。

3、1994年，Aversa等2在对白血病患者实施3个HLA位点不合的去T细胞骨髓移植的同时，还给患者移植了用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的大剂量供者外周血干细胞（移植物中干细胞的平均数比单独骨髓移植高710倍），结果17例晚期白血病患者中只有1例发生移植物排斥，16例均获得了长期、稳定的植入。中性粒细胞和血小板的恢复也十分迅速，移植特征与同基因外周血干细胞移植非常相似。提示在去T细胞移植中，干细胞数量起了关键性的作用。移植成功率与干细胞数量呈正相关，想获得更多的HSC的可能途径就是在体外用细胞因子刺激骨髓，使HSC扩增。但是HSC在扩增的同时其自我更新能力也逐渐丧失，因此这条途径目前难以

4、实现。相比之下，用细胞因子体内动员的HSC则可保持其自我更新的能力，并且动员后外周血中的干细胞数可大大增加，Reisner等1用G-CSF动员外周血干/祖细胞，移植给34例高危急性白血病患者，供者为与受者有3个HLA位点不相合的亲属。他用两步法去除T细胞：首先通过E-玫瑰花结除去G-CSF动员的外周血单个核细胞中的T淋巴细胞，然后通过亲和素-生物素免疫层析法阳性筛选CD34+细胞。平均移植CD34+细胞数为15×106/kg，输入的CD3+细胞数为22×103/kg。在未使用任何移植后处理预防GVHD的情况下，所有患者都获得了供者型植入，没有一例发生急、慢性GVHD。总的来

5、看，与接受HLA相合的、无关供者移植同期患者的移植相关死亡率和无病存活率非常接近。表明使用“超剂量”纯化CD34+细胞进行移植，完全可以克服半相合的异体移植所存在的遗传学屏障。Handgretinger等3根据临床经验也得出类似的结论：在进行HLA半相合的移植时，所用CD34 HSC数应>20×106/kg。他们将G-CSF动员的父(母)外周血CD34 HSC移植给23例不同疾病的患儿。采用磁性细胞分选法(Super MACS和Clini MACS)筛选CD34细胞，纯度达到98%99%，平均移植CD34细胞为14.2×106/kg范围在(5.439.0）×

6、106/kg，平均输入T细胞1.4×104/kg。有18例患者初次移植成功，4例在二次移植后也获得了完全、持续的造血重建。跟踪观察结果显示：免疫重建的速度决定于植入的CD34细胞数，当植入CD34细胞>20×106/kg时，免疫重建速度明显加快。以上资料提示，对于那些没有合适供者的患者来说，“超剂量”半相合的CD34细胞移植是一种理想的治疗手段。2CD34细胞诱导免疫耐受能力的实验证据增加干细胞数量就可实现半相合异体移植，从表面上看似乎是由于供者干细胞压过了受者干细胞，但不能排除还存在其它机制的可能，如辅助细胞作用等。动物实验提供了一些间接的证据4。给受者小鼠C3H/

7、Hej移植普通骨髓移植45倍剂量的C57BL/6小鼠去T细胞骨髓，结果使受亚致死剂量(6.5?Gy)照射的受鼠骨髓完全为供鼠细胞类型所替代。细胞毒性T淋巴细胞前体(CTL-p)分析显示：小剂量骨髓移植时，抗供者CTL-p数量显著增加；在接受“超剂量”去T细胞骨髓移植的受者体内却检测不到此类CTL-p。提示在去T细胞的异体移植中，对移植物的排斥主要是由经亚致死剂量处理后仍残存的宿主CTL-p介导的，而在“超剂量”HSC移植时，这些抗供者的CTL-p受到了抑制。CD34细胞是否能特异性地抑制宿主抗供者的CTL-p，Rachamim等5采用混合淋巴细胞反应(MLR)进行研究。从G-CSF动员的去T细

8、胞外周血中纯化出CD34细胞，然后通过MLR检测它们诱导特异性耐受的能力。实验中，CD34细胞的纯度为57%92%，T细胞仅占0.05%0.25%。在初次MLR中，1.2×106/ml供者C来源的应答细胞(CTL-p)分别与经过30Gy照射的来源于供者A和B的相同数目的刺激细胞共培养，加入或不加1.2×106/ml供者A来源的CD34细胞，以检测它们诱导免疫耐受的能力。培养5 d，从反应体系中分离出应答细胞，再与51Cr标记、ConA活化、与来源于相应供者(A或B)的靶细胞反应7 d，通过检测?51?Gr的释放判断CTL的杀伤活力。在3组独立实验中，由于CD34细胞的加入，

9、使二次培养中CTL杀伤供者A来源的靶细胞的活力显著下降(P<0.01)，而对第三供者B来源的靶细胞杀伤活力仅受到微弱的抑制(P>0.5)。表明C供者来源的应答细胞(CTL-p)受到A供者来源的CD34细胞的诱导，对同一供者A来源的刺激细胞产生了特异性耐受，而对第三供者B来源的刺激细胞则不耐受。为了测定可以有效抑制宿主抗供者CTL产生所需要的最低CD34细胞数，Rachamim等又建立了两组MLR(C抗A和C抗B，应答细胞和刺激细胞数目相等)，然后向其中加入供者A来源的不同数量的纯化CD34细胞(5×106，5×105和5×104)，培养5 d，用荧光标

10、记的抗CD34和CD3的单克隆抗体标记后，进行双色流式细胞仪分析。结果表明CD34细胞抑制异体反应性CTL具有明显的剂量依赖性：若刺激细胞与CD34细胞来源于同一供者A，当加入CD34细胞数与应答细胞数比例分别为01，0.011，0.11和11时，对异体反应性CTL活力的抑制分别为0，8%，10%和50%；但若刺激细胞来源于第三供者B，则无抑制产生。从而进一步证明供者CD34细胞数与受者免疫耐受能力的诱导直接相关。另外，CD34细胞也具有典型的否决细胞特征6，其否决能力对射线敏感、对细胞接触存在依赖性。30?Gy的射线照射后，CD34细胞诱导CTL-p特异性耐受能力消失；将CD34细胞加入Ta

11、nswell培养板中，与应答细胞用一半透膜隔开，细胞因子可以穿过半透膜而细胞不能，即CD34细胞和应答细胞不能直接接触，则其诱导耐受能力也消失。3CD34细胞的表型及其诱导免疫耐受机制的探讨T细胞活化至少需要2个信号：第一信号由T细胞受体与抗原-MHC复合物的相互作用提供；第二信号由共刺激分子与其在T细胞上的受体相结合提供。辅助刺激存在与否是决定与抗原-MHC复合物相互作用后的T细胞出现活化还是耐受的重要因素。如果在T细胞受体结合抗原时不存在辅助刺激信号，就可导致T细胞对细胞因子或抗原提呈的无应答性。分析CD34细胞表型，发现95%以上的CD34细胞表达HLA-DR，而仅0.13% CD34细

12、胞表达B7-1(CD80）和(或)B7-2(CD86），并且在加MLR体系后，培养5 d，B7-1和B7-2的表达仍为阴性5。B7-1和B7-2都属于目前研究最清楚的共刺激分子家族B7家族，它们在T细胞上的受体为CD28和CTLA4。Gribben等7发现，即使在抗原提呈细胞表面存在其它可能的共刺激分子，仅封锁B7家族共刺激分子就足以诱导耐受。若要诱导抗原特异的耐受，则在封锁异体反应性T细胞表面B7家族介导的共刺激信号的同时，必须保留完整的异体抗原识别和粘附能力。因此，CD34细胞能够诱导受者对其表达的抗原特异性耐受的机制，可能与其高表达HLA-DR而低表达共刺激分子B7-1和B7-2有关。因

13、此，选择CD34 B7-亚群进行异体移植，可能比整个CD34细胞群或全骨髓移植更易诱导耐受。最近报道8，在对1例慢性粒细胞白血病患者实施“超剂量”HSC移植后3个月，仍没有检测到供者类型的CD4或CD8 T细胞，而供者类型的CD56 NK细胞以及CD34干/祖细胞和髓系细胞都迅速增加。因为在移植物中并无T或NK细胞，而CD34细胞迅速分化成NK细胞是“超剂量”干细胞移植的典型特征，因此推测，NK细胞的产生可能与克服异体移植的HLA屏障、获得稳定植入有关。具体机制有待进一步研究。4应用前景“超剂量”HSC的应用可减轻患者预处理4，9,因此可用于某些非恶性疾病的治疗，如部分遗传性疾病、代谢性疾病、

14、自身免疫性疾病等。对这些患者来说，可能致死的预处理条件并非疾病所必需。另外，在器官移植前，应用“超剂量”干细胞移植可诱导受者对供者组织的特异性耐受，可使受者持久地接受同一供者来源的器官而不发生排斥，这在器官移植具有十分重要的价值。但是，超剂量HSCT治疗白血病患者高度并发感染，这主要是由于T细胞重建的延迟。即使在这段时期应用抗病毒和抗真菌的药物，细菌和真菌感染仍是导致白血病无关死亡的主要原因。T细胞恢复慢可能是因为移植物中T细胞含量低，也可能是由于CD34 HSC向T细胞分化的能力较差10。有人提出CD34- HSC比CD34 HSC更原始，且具有更广泛的分化潜能，用Lin- CD34- HS

15、C移植NOD/SCID小鼠，能够快速重建T系造血11-13。那么，是否CD34- HSC也具有诱导机体特异性免疫耐受的能力，从而成为更加有效的干细胞来源而应用于移植治疗呢?有待进一步的研究验证。 (校对：王汝瑞)王冬梅（100850北京，军事医学科学院放射医学研究所、国家生物医学分析中心）裴雪涛（100850北京，军事医学科学院放射医学研究所、国家生物医学分析中心）参 考 文 献1，Reisner Y, Bachar-Lustig E, Li HW, et al, The role of megadose CD34 progenitor cells in the treatment of le

16、ukemia patients without a matched donor and in tolerance induction for organ transplantation. Ann NY Acad Sci, 1999, 827:336-350.2，Aversa F, Tabilio A, Terenzi A, et al. Successful engraftment of T-cell-depleted haploidentical “three-loci" incompatible transplants in leukemia patients by additi

17、on of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood progenitor cells to bone marrow inoculum. Blood, 1994, 84:3948-3955.3，Handgretinger R, Schumm M, Lang P, et al. Transplantation of megadoses of purified haploidentical stem cells. Ann NY Acad Sci, 1999, 827:351-

18、362.4，Bachar-Lustig E, Rachamim N, Li HW, et al. Megadose of T-cell-depleted bone marrow overcomes MHC barriers in sublethally irradiated mice. Nat Med, 1995, 1:1286-1273.5，Rachamim N, Gan J, Segall H, et al. Tolcrancc induction by "megadose" hematopoietic transplants: doner-type human CD3

19、4 stem cells induce potent specific reduction of host anti-doner cytotoxic T lymphocyte precursors in mixed lymphocyte culture. Transplantation, 1998, 65:1386-1393.6，Rachamim N, Gan J, Segall H, et al. Potentital role of CD34 stem cell in tolerance induction. Transplantation Pro, 1997, 29:1935-1936.

20、7，Gribben JG, Guinan EC, Boussiotis VA, et al. Complete blockade of B7 family-mediated costimulation is necessary to induce human alloantigen-specific anergy: a method to ameliorate graft-versus-host disease and extend the donor pool. Blood, 1996, 87:4887-4893.8，Bornhauser M, Thiede C, Brendel C, et

21、 al. Stable engraftment after megadose blood stem cell transplantation across the HLA barrier: the case for natural killer cells as graft-facilitating cells. Transplantation, 1999,68:87-88.9，Megan S, Gregory LS, Kirsten AS, et al. Induction of high levels of allogeneic hematopoietic reconstitution and do