胸腺内注射可溶性异基因主要组织相容性复合物抗原诱导皮肤移植特

1、    胸腺内注射可溶性异基因主要组织相容性 复合物抗原诱导皮肤移植特异性耐受        摘要用3mol/L KCl从C57BL/6小鼠脾细胞提取可溶性主要组织相容性复合物(MHC)抗原， 注射到BALB/C受体鼠胸腺内，诱导了成年小鼠对该异基因小鼠皮肤移植物的耐受。除在胸腺注射当天及第3天给予抗T细胞单克隆抗体外，不使用免疫抑制剂。实验组移植皮肤平均存活时间(MST)为83天，对照组MST为11天。诱导耐受的小鼠对第3供体的移植皮肤仍正常排斥(MST为12天)

2、。单向混合淋巴细胞反应，耐受小鼠脾脏淋巴细胞对特异供体的脾细胞无反应，对第3供体的脾细胞反应正常,对丝裂原刺激的增殖反应正常。显示诱导的耐受是供体特异性的，无非特异性免疫抑制。关键词主要组织相容性复合物免疫耐受性胸腺注射 Induction of donor-specific tolerance to skin graft by intrathymic inoculation of allogeneic histocompatibility antigen from C57BL/6 miceShi Wei*, Zhong Xiaozhu, Zhang Shiguang, et al. *Ren

3、al Research Institute, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080AbstractIntrathymic (IT) inoculation of allogeneic major histocompatibility complex (MHC) soluble antigen extracted from C57BL/6 inbred mice splenocytes using 3mol/L KCl was performed to ind

4、uce donor-specific tolerance to skin allografts in adult BALB/C mice. The recipients(BALB/C) received anti-T lymphocyte monoclonal antibodies (mAb) 8.4g on 0 and 3rd day relative to IT injection of allogeneic MHC antigen without other immunosuppressant. The control group received anti-T lymphocyte m

5、Ab 8.4g but IT injection of normal saline (NS). Median survival time (MST) of transplanted skin allografts was 83 days in tolerant recipients while normally rejected 3rd-party CBA/J skin grafts (MST 12 days). In the control group, skin grafts MST was 11 days. Responder cells of tolerant recipients t

6、o C57BL/6 stimulators showed significantly less incorporation in oneway mixed lymphocyte reaction but in normal fashion to third-party CBA/J stimulators. The results suggested that unresponsiveness can be induced by IT inoculation of soluble allogeneic MHC antigen which was donor-specific. Key words

7、Major histocompatibility Immune tolerance Thymus gland Injections我们用3mol/LKCl从异基因供体小鼠脾细胞提取可溶性主要组织相容性复合物(MHC)抗原行受体鼠胸腺内注射，诱导了成年小鼠皮肤移植的特异性耐受。材料与方法一、动物：受体鼠为BALB/C(H-2d)；供体鼠为C57BL/6(H-2b)；第3供体鼠为CBA/J(H-2k)。所用各近交系小鼠均为雄性，810周龄。二、供体MHC抗原制备1：C57BL/6小鼠脾脏制成脾细胞悬液，低渗裂解法除去红细胞，以10倍体积的磷酸盐缓冲液(PBS)将脾细胞重新悬浮，4、搅拌下缓慢加入结

8、晶KCl至浓度为3mol/L，4下持续搅拌16小时。40000r/min离心60分钟，上清液置透析袋中，在500g/L蔗糖溶液中浓缩，置PBS液中透析16小时，40000r/min离心60分钟。取上清液按文献方法2测定蛋白含量。三、胸腺注射：小鼠麻醉后仰卧位固定四肢，在胸骨上窝正中切开皮肤，钝性分离,暴露胸腺上极，用眼科无齿镊轻轻固定胸腺，以4(1)/(2)号针头向胸腺左右两叶各注射50l抗原(共2mg)，迅速缝合皮肤。四、实验分组及抗原注射：受体鼠45只，分为5组：实验组(n=12)及第3供体组(n=9)胸腺内注射C57BL/6小鼠的MHC抗原2mg；尾静脉注射组(n=8)经尾静脉注射C57

9、BL/6小鼠的MHC抗原2mg。对照组1(n=8)、2(n=8)胸腺内注射生理盐水。五、皮肤移植：MHC抗原注射当天及第3天，除对照组1外各组小鼠均给予抗小鼠CD3单克隆抗体(GIBCOBR2)腹腔注射(每只鼠2次共8.4g)。注射单克隆抗体2周后进行皮肤移植。除第3供体组移植CBA/J小鼠的尾部皮肤外，其他各组移植C57BL/6小鼠的尾部皮肤。移植按文献3介绍方法进行。以皮片结痂、变硬或皮片上毛脱落作为判断排斥的标准。结果用皮片平均存活时间(MST)表示。六、脾细胞增殖反应的测定：各组小鼠于MHC抗原注射后第4周分离脾细胞，按文献方法4，用氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR，中国原子能科学院)

10、掺入法测定脾细胞对丝裂原的增殖反应。七、混合淋巴细胞反应：各组小鼠于MHC抗原注射后第4周分离脾细胞，3H-TdR掺入法分别测定对供体或第3供体的单向混合淋巴细胞反应。结果一、皮肤移植：在对照组1，移植皮肤的MST为9天，对照组2的MST为11天。在尾静脉注射组，移植皮肤的MST为12天，与对照组2相似(P0.5)。实验组移植皮肤的MST为83天，与对照组2及尾静脉注射组相比，存活时间显著延长(P0.01)。第3供体组对CBA/J小鼠的皮肤仍正常排斥，移植皮肤的MST为12天，与对照组2相似。二、受体鼠脾细胞对丝裂原的增殖反应：MHC抗原注射4周后进行淋巴细胞转化试验，各组小鼠淋巴细胞对Con

11、A(Sigma)的增殖反应均在正常范围(1)。     三、单向混合淋巴细胞反应(MLR)：MHC抗原注射后4周，取各组小鼠脾淋巴细胞做单向MLR。对照组1、2及尾静脉注射组的刺激细胞为C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞，3个组的单向MLR均呈正常反应。实验组及第3供体组淋巴细胞对C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞无反应，但对CBA/J小鼠的脾淋巴细胞呈正常反应(2)。     讨论近年来免疫学研究发现，T细胞在胸腺内的发育过程中，能与自身MHC抗原发生反应，被诱导发生克隆删除或克隆无反应,无自身反应性的T细胞克隆被保留，

12、发育成熟并迁出胸腺。此阴性选择即为自身耐受形成的基础5。根据此自身耐受机制，如果T细胞在胸腺内接触到异基因的MHC抗原，则会被诱导出对该异基因外周移植物的耐受。Remuzzi等6将异基因供体大鼠的肾小球注射到成年受体大鼠胸腺内，在不使用免疫抑制剂的情况下，胸腺外异基因移植肾得到长期存活。随后的研究者将骨髓细胞及脾细胞注射到异基因大鼠胸腺内诱导耐受，分别获得了心脏、肾脏及肝脏移植物在外周的长期存活。但以上研究所用的供体抗原均为细胞，且所用模型均为血管性移植物。我们用3mol/LKCl从小鼠脾细胞中提取可溶性MHC抗原行胸腺内注射，诱导耐受，且脾细胞中的B细胞有丰富的MHC类及类抗原。我们在注射M

13、HC抗原的当天及第3天，分2次注射抗T细胞单克隆抗体，以清除外周循环中已存在的T细胞。因注射单克隆抗体所致的免疫抑制可持续2周6，故我们在注射单克隆抗体2周后进行皮肤移植，以避免其影响实验结果。对照组2与对照组1相比，移植皮肤存活期无延长(P0.5)，是因2周后外周血中T细胞已恢复正常。此结果显示我们的实验结果未受注射单克隆抗体的影响。在实验组，由于2周后外周循环中从胸腺迁移出来的T细胞在胸腺内经历了供体MHC抗原的诱导，因而对供体移植物产生耐受5。与对照组2相比，实验组移植皮肤的存活时间显著延长(P0.01)。第3供体组对CBA/J小鼠皮肤仍正常排斥，显示所诱导的耐受是供体特异性的。尾静脉注

14、射组与对照组2相比，移植皮肤存活时间无延长，显示胸腺外途径注射供体MHC抗原不能诱导产生耐受。在MLR中，实验组及第3供体组的淋巴细胞均对C57BL/6小鼠的脾细胞无反应，而对CBA/J小鼠的脾细胞呈正常反应，从细胞免疫的水平证实诱导的耐受是供体特异性的。实验组小鼠的脾细胞对丝裂原刺激增殖反应正常，说明在产生耐受的同时，细胞免疫功能并未受到抑制。我们的结果说明胸腺内注射供体细胞不是唯一的诱导方式。可溶性MHC抗原可通过胸腺树突状细胞呈递抗原的间接途径呈递而被发育中的T细胞识别。由于皮肤移植物内含有供体淋巴细胞及树突状细胞，且皮肤为非血管性移植物，因而在移植耐受的研究中，皮肤比心脏、肾脏及肝脏等

15、血管性移植物更难获得长期存活，所以皮肤移植模型是观察耐受状态的可靠模型。本课题为国家自然科学基金资助项目作者单位：510080广州，中山医科大学附属第一医院肾脏研究所史伟、张仕光、陈永雄；第一军医大学附属珠江医院肾移植中心钟晓祝、高伟；史伟现在广东省人民医院，邮政编码：510080参考文献1Didlake R, Kim EK, Kahan BD. Ability of 3M KCl-extracted histocompatibility antigen to potentiate the immunosuppressive effect of cyclosporine to prolong

16、of heterotopic rat cardiac allografts. Transplantation, 1988, 46:743-747.2Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72:248-254.3Hdstad ST, Wren SM, Bluestone JA, et al. Charac

17、-terization of mixed allogeniec chimeras: immunocom-petence, in vitro reactivity, and genetic specificity of tolerance. J Exp Med, 1985, 162:231-244.4Mayumi H, Himeno K, Shin T, et al. Drug-induced tolerance to allografts in mice(). Immunobiology, 1985, 169:147-161.5Ramsdell F, Fowlkes BJ. Clonal deletion versus clonal anergy: the role